А.Ф.Иваницкая, М.А.Пешков и др. "Петр Иванович Живаго" Издательство "Наука", Москва, 1975 г. OCR Biografia.Ru
продолжение книги...
Глава вторая Вклад П. И. Живаго в изучение тонких цитологических структур (ядра, ядрышка и веретена)
Еще в 1926 г. П. И. Живаго производил исследования прижизненных структур в ядрах лейкоцитов крови лягушки на серии микрофотографий и микрокинограмм. Его, как и многих других цитологов, глубоко волновал вопрос о соотношении картин, наблюдаемых в живой и фиксированной клетке, и в частности о прижизненном существовании тех сложных структур, которые обнаруживаются в ядре убитой клетки, в противоположность его оптической пустоте в живом состоянии. Особенно важным представлялось ему изучение таких вопросов, как строение покоящегося ядра и переходные стадии между интеркинезом и митозом. Живаго решил включиться в изучение этих сложных вопросов, использовав возможно более совершенную методику микрофотографических и микрокинематографических исследований. В качестве объекта своей работы, проведенной весной 1926 г., он избрал клетки белой крови лягушки — лимфоциты и лейкоциты. Густая капля крови немедленно после извлечения из пальца или чаще сердца лягушки, без добавления физиологического раствора и предохраненная от соприкосновения с воздухом, помещалась на предметное стекло; высокая рамка из вазелина и тонкое покровное стекло создавали благоприятные условия для длительного переживания клеток в такой камере. Специально проводившийся контроль позволил убедиться в том, что в данном случае отсутствовали повреждающие воздействия (давление, изменение реакции среды, подсыхание, перегрев от источника освещения). Препарат без каких-либо изменений сохранялся в течение многих часов. Именно к такому препарату клеток крови Живаго применил некоторые оптические усовершенствования, позволившие ему обнаружить прижизненную структуру в лимфоцитах и лейкоцитах лягушки. Результаты этого исследования ученый опубликовал осенью 1926 г. В первой серии исследований он проводил микрофотографирование, пользуясь фокусировочной лупой и матовой плоскостью микрофотографической камеры, выдвинутой на 35—40 см. В следующей части работы был применен метод микрокиносъемки, только входивший в то время в обиход научного исследования. В этих исследованиях большую помощь ему оказал профессор В. Н. Лебедев — один из пионеров биологической микрокиносъемки в нашей стране (Живаго выразил ему в работе особую благодарность). В микрокинематографическом исследовании каждая экспозиция длилась 3/4 секунды, пауза между двумя съемками — такое же время. Съемка продолжалась 5 минут, и, судя по энергичному образованию псевдоподий, состояние изучаемых клеток было вполне физиологичным. Работа П. И. Живаго по изучению прижизненного строения ядер имела очень большое принципиальное значение. В то время, почти 50 лет назад, когда микроскописты работали преимущественно, как академик С. Г. Навашин, с недостаточно сильным дневным светом или применяли искусственные источники, пользуясь при этом вогнутым зеркалом, что не позволяло полностью реализовать возможности высокоапертурных систем микроскопа, Живаго одним из первых применил прецизионную методику овещения по Кёлеру и настроил микроскоп на работу с полной апертурой иммерсионного объектива, прибегая и к иммерсии конденсора. В результате он пришел к следующим выводам. 1. В живом «покоящемся» ядре лейкоцита лягушки присутствуют нитевидные образования. 2. Эти образования способны производить оживленные движения, носящие перистальтический характер.
3. Высокий показатель преломления и тот факт, что эти нити не подчиняются законам гидростатики и при своих движениях и соприкосновениях не сливаются, является показателем их гелеобразного состояния. 4. Возможность наблюдения ядерных нитей при достаточном увеличении и правильном освещении в светлом поле говорит за то, что они не являются фазой какого-то коллоида, а представляют из себя самостоятельный коллоид или систему коллоидов. 5. Сравнение картин, наблюдаемых в живых клетках, с таковыми фиксированных и окрашенных препаратов позволяет заключить, что современное представление о периферической ядерной сети в основном соответствует данным витальных наблюдений. В это представление следует, однако, внести существенные поправки. Так, эти желатинизированные сети не образуют истинной сети, поскольку они только перекрещиваются, никогда не сливаясь в точках соприкосновения. Поскольку они желеобразны, при фиксации появляются более или менее достоверные картины, которые, однако, в силу коагуляции кариолимфы, как соля, загрязняются и искажаются образующимися при этом коагулятами. 6. Описанные нити соответствуют морфологическому представлению «линина» или «хромонем». Их также можно расценивать как структуры, из которых образуются во время митоза типичные хромосомы. Эти наблюдения служат хорошей поддержкой учению о непрерывности существования хромосом. 7. При всех заслугах ультрамикроскопии в деле изучения фаз коллоидов и обнаружения микроорганизмов, видимость которых исчезает в светлом поле даже при максимальном увеличении, наблюдение живых клеток при освещении по методу темного поля не дало существенных результатов. Это явное бессилие ультрамикроскопии привело к представлению об «оптической пустоте» покоящегося ядра. По-видимому, это является результатом резкого общего освещения поверхности ядра, чем и достигается эффект темного поля. Два года спустя П. И. Живаго продолжил свою работу по изучению прижизненного строения ядер, используя методику фотографического контраста. Эту методику разработал киевский исследователь В. И. Фаворский (1), который ставил своей задачей применить разработанный им метод озобромного усиления невидимых контрастов и ничтожных цветовых различий к изучению живой клетки. В качестве объекта своего исследования он избрал деление ядра в тычиночных волосках традесканции, изучаемых на предметном стекле в капле очень слабого раствора сахара. Фавор-
--------------------------------------------------------------------
1. В. И. Фаворский. Новый метод исследования клетки.— «Зап. Киевского об-ва естествоиспытателей», 1926, т. 27, вып. 1, стр. 71—76.
--------------------------------------------------------------------
ский сообщил, что во влажной камере приготовленный препарат долго оставался физиологически полноценным. Способность клеток к делениям сохранялась в течение двух суток — автор имел возможность наблюдать повторные деления одной и той же клетки. П. И. Живаго взял за основу своих исследований метод Фаворского. Однако, по-видимому, его больше интересовал прежний объект — покоящееся ядро. Кроме того, репродукции с фотографий, приведенных в работе Фаворского, по своему низкому качеству не могли удовлетворить Живаго. Поэтому, изложив принцип Фаворского, Живаго сообщает о результатах собственного исследования, выполненного с некоторыми методически новыми приемами на эритробластах и оогониях лягушки. В этой работе Живаго получил важные цитологические данные в результате применения к исследованию живой клетки уникальных методов выявления неразличимых глазом деталей с использованием фотографического метода цветоотделения, изобретенного Е. Ф. Буринским для целей судебной экспертизы и прочтения невидимых надписей. Принцип Буринского, несмотря на существование в наше время мощных и удобных микроскопов, как фазово-контрастный, аноптральный, амплитудо-контрастный (объективы-люки Пешкова) и интерференционный, до сих пор не утратил своего значения. Он может быть применен и к микрофотографиям, полученным с помощью этих приборов, и к электроннограммам. После выполнения своей сенсационной работы о прижизненной видимости хромонем в лейкоцитах лягушки, где микрофотографии производились по методу светлого поля со строгим соблюдением правил освещения по Кёлеру, Живаго, всегда бывший в курсе всех достижений передовой микроскопической техники и часто заглядывавший вперед, решил продолжить единичный опыт Фаворского с растительной клеткой и применить метод Буринского, так удачно видоизмененный Фаворским, использовавшим преимущества озобромного способа к изучению живых структур. «Пока мне хотелось бы лишь констатировать,— писал Живаго,— что представляющиеся часто гомогенными живые ядра ири применении контрастирующего фотографического анализа оказываются структурированными и содержат блестящие «ахроматиновые нити», представляющие, с моей точки зрения, важнейшую основу ядерных структур, переход от коих к фигурам митотическим не связан с теми трудностями, какие неизбежно встречаются на нашем пути, если мы начинаем подходить к возникновению этих фигур с точки зрения бесструктурности покоящегося ядра» (2). Поскольку рассматриваемый метод мало известен как микрофотографам, так и цитологам-микроскопистам, следует вкратце напомнить его принципиальную основу. Метод Буринского, первоначально применявшийся для целей судебной экспертизы, был основан на доведении малых контрастов в объекте, не воспринимаемых человеческим глазом, до ясной видимости на фотографиях. Сам Буринский, разработавший этот способ, назвал его методом фотографического цветоделения. «Его сущность заключается в том, что снятые с двух одинаково экспонированных негативов или позитивов пленки, сложенные вместе, нарушают первоначальное соотношение гнетов и теней, так как удвоенный теневой слой пропускает количество света не в два, а в четыре раза меньше по сравнению с пропусканием одного слоя. Например, если соотношение между двумя рядом находящимися плотностями определяется как 2:3, то есть d : d1 = 2: 3, то при удвоении этих плотностей получится 2d:2d1 = 4:9. Если эти плотности вновь удвоить, то разница между ними сделается еще больше, так как 4d: 4d1 = 16 : 81. Первоначальное соотношение плотностей в приведенном примере (2:3) очень велико, поэтому результат цветоделения представляется быстрым, а усиление контраста — очень большим. На самом деле, действительность дает значительно меньшие величины, и если вначале контраст равен, например, отношению 2 : 2,001, то ясно, что крайне кропотливая и требующая достаточного навыка работа по снятию и суммированию пленок с негативов и диапозитивов сопряжена с огромной затратой времени и труда. Последнее обстоятельство привело к попыткам видоизменить метод Буринского. Употреблявшиеся им негативы мокрого коллоидного способа стали заменяться негативами сухих броможелатинных пластинок. Вместо совмещения пленок с нескольких негативов, снятых непосредственно камерой,
-----------------------------------------------------------
2. П. И. Живаго. О применении метода В. И. Фаворского к прижизненному исследованию ядерных структур.— «Изв. ассоциации Н. И. И. при физмате МГУ», 1928, т. 1, вып. 1—2, стр. 179—183.
-----------------------------------------------------------
Поповицким предложено обливать один и тот же негатив светочувствительной коллоидной эмульсией и последовательно его вновь экспонировать, проявлять и закреплять. Наконец, вместо наложения пленок Фаворский предложил накладывать озобромированный пигментный слой» (3). История работ Буринского по фотографическому цветоделению изложена в одной из статей Фаворского (4). «Буринский вынес свою деятельность за пределы криминалистической фотографии. В 1894 г. он был приглашен Академией наук для восстановления текста документов на коже времен Дмитрия Донского, найденных при раскопках Кремля. Документы эти от долгого лежания под землей были сильно повреждены сыростью и ржавчиной — на них не видно было ни одной буквы. Академики Бекетов и Бейльштейн, известные химики, напрасно потратили много времени и труда, пытаясь химическими способами обнаружить текст, и наконец вынуждены были донести Академии, что на поверхности кожи не осталось ни малейшего химически ощутимого следа пишущего вещества. Буринскому вполне удалось восстановить текст всех этих документов. Очевидно, что между цветом букв и цветом фона существовало некоторое различие, хотя настолько малое, что оно не было ощутимо для глаза. Фотографическим путем оказалось возможным увеличить этот ничтожный контраст в громадной степени и таким образом сделать его заметным для глаза.
Этот случай и положил начало славе и широкой известности Буринского и его метода! В 1896 г. напечатана его статья (5) о цветоделительной фотографии, как он называл свой метод, статья, за которую ему была присуждена премия имени Ломоносова». Метод Буринского скоро попытались применить в различных областях естествознания. «Успех этих первых опытов дал мысль академику Фаминцину применить метод Буринского еще в одной области науки — к исследованию живой клетки. Однако попытки эти увенчались очень малым успехом: Фаминцину удалось сделать несколько моментальных снимков живых инфузо-
-------------------------------------------------------------
3. Цит. по: С. М. Потапов. Судебная фотография. М., 1948, стр. 156—157.
4. В. И. Фаворский. Обнаружение и прочтение невидимых надписей с помощью озобромного процесса.— «Вестник фотографии», 1909, № 9, стр. 201—210.
5. Е. Ф. Буринский. Записка об усовершенствованиях, достигнутых в фотографии.— «Изв. имп. Акад. наук», 1896. т. IV, № 3, стр. 315—340.
--------------------------------------------------------------
рий, на что в обычных условиях потребовалась бы экспозиция не менее минуты (что, конечно, делало невозможной микрофотографию живой движущейся клетки), но на снимках этих не обнаружилось ничего такого, чего нельзя было бы видеть непосредственно глазом в микроскоп. Фотография в опытах Фаминцина оказалась только регистрирующей, а не исследующей. Кроме того, получившиеся микрофотографии даже как рисунки оставляли желать многого» (6). Как бы то ни было опыты применения цветоделительного метода к микрофотографиям более никем не повторялись. Таким образом, метод Буринского остался только в судебной и археологической фотографии. В этой области Буринский довел свой метод до такого совершенства, что, по его собственным словам, «теперь нет средств свести с бумаги без порчи ее следы письма таким образом, чтобы фотография была бессильна их обнаружить» (7). Больше того, «Буринскому удавалось прекрасно даже восстановление полимпсестов, т. е. пергаментов, служивших в течение веков несколько раз, причем каждый новый раз старая надпись тщательно удалялась. В этом случае задача еще трудней, так как надо не только восстановить прежнюю надпись, но и уничтожить новую, которая иначе будет мешать прочтению старой, переплетаясь с ней. И однако, несмотря на все его могущество, метод Буринского в то время да и теперь не только не получил всеобщего распространения в науке, но даже и в области судебной фотографии его в значительной степени вытеснили другие методы, по большей части даже более старые и несравненно менее его могущественные» (8). Причина этому — крайняя сложность и кропотливость метода Буринского. «А. А. Поповицкий, работая в экспедиции заготовления государственных бумаг, пробовал упростить цветоделительный метод, заменив мокрый коллодионный способ фотографированием на бромистых пластинках. Для снимания с них пленок Поповицкий применял так называемый «отофильм» Евдокимова, то есть раствор поташа и едкого кали в воде,
-------------------------------------------------------
6. В. И. Фаворский. Обнаружение и прочтение невидимых надписей с помощью озобромного процесса.— «Вестник фотографии», 1909, № 9, стр. 203.
7. Там же, стр. 204.
8. Там же.
--------------------------------------------------------
который позволяет так снять слой, чтобы он совершенно не изменился при этом в величине» (9). Все же метод не избавлял работающего от совмещения негативных пленок вручную. Следующим усовершенствованием метода Буринского был способ озобромной обработки фотоматериалов. Способ основан на том, что пигментная бумага (бумага, политая слоем желатины, содержащей водонерастворимую мелкодисперсную краску, и затем высушенная) «очувствляется» в особом озобромном растворе, содержащем кроме воды бихромат калия, красную кровяную соль, бромистый калий, уксусную кислоту, соляную кислоту и формалин. «Очувствленная» пигментная бумага прикатывается к предварительно задубленному негативу. В течение этого времени озобромный раствор из бумаги диффундирует в серебряный слой негатива и вызывает его отбеливание. При этом образуются окислы хрома, диффундирующие в слой желатины пигментной бумаги и вызывающие его дубление, степень которого пропорциональна содержанию серебра в слое отбеленного негатива. В результате в прикатанной к негативу пигментной бумаге появляется рельеф из задубленной желатины, полностью повторяющий распределение света и теней в негативе: в пигментном желатиновом слое возникает рельефный дубль-негатив. Поместив негатив с прикатанной к нему пигментной бумагой в теплую воду, вызывают плавление незадубленной желатины. В итоге на отбеленном серебряном негативе остается его пигментная копия. Ясно, что там, где в негативе больше серебра, возникает более глубокое дубление слоя с пигментом и, наоборот, в светлых участках негатива, где серебра мало или оно вовсе отсутствует, образуется более тонкий задубленный слой пигмента или его вообще не образуется. После этого, задубив до конца нежный рельефный пигментный слой раствором формалина, производят чернение отбеленного серебра негатива в амидоловом проявителе (не содержащем щелочи), высушивают восстановленный негатив и наслоенный на него его точный дубль. Нетрудно убедиться в достоинствах негатива, полученного этим методом. «Очень сильно недо-
----------------------------------------------------------
9. В. И. Фаворский. Обнаружение и прочтение невидимых надписей с помощью изобромного процесса.— «Вестник фотографии», 1909,
стр. 205.
----------------------------------------------------------
держанные снимки, исправленные серебром,— пишет В. Фаворский,— на первый взгляд кажутся нормальными: та же густота негатива и та же общая контрастность. Но если сличить такой негатив с негативом, снятым с того же предмета с нормальной экспозицией, то оказывается, что оба резко различаются между собой контрастностью отдельных мест. На негативе недодержанном и исправленном окажется мало контрастов там, где на нормально выдержанном их много, но зато на недодержанном оказываются контрасты и детали, которых совершенно нет на нормальном и которые иногда даже на снимаемом предмете можно заметить только после того, как эти детали найдены на недодержанном снимке» (10). Экспериментируя с данной методикой, Фаворский выявил надписи, сделанные кисточкой, смоченной в воде, на фильтровальной бумаге. После нанесения надписей бумагу высушивали, размачивали в воде и снова высушивали. Применением озобромного способа к недодержанным негативам такого объекта удавалось безошибочно выявить надписи. Дело в том, что негатив, несущий на себе один пигментный дубль, может быть использован еще раз для нанесения тем же способом поверх первого и второго дубля. Это приводит после нового чернения отбеленного серебряного негатива в проявителе к получению автоматически точно совмещенных трех негативов. Обычно этого совершенно достаточно для «вытягивания малоконтрастных деталей объекта...» (11). Сам Живаго на долгие годы расстался с методами контрастирования, занявшись другими цитологическими проблемами, о чем речь будет ниже. Ввиду отсутствия пигментных бумаг в течение долгих лет нельзя было возобновить работы по цветоделительной методике Буринского — Фаворского, так удачно примененного Живаго к изучению живой клетки. Однако было бы несправедливо не показать то исключительное влияние, которое оказали новаторские приемы Живаго на получение принципиально новых и важных результатов в области цитологии и кариологии бактерий, представления о ядерном аппарате которых находилось в то время в самом хаотическом состоянии.
----------------------------------------------------------
10. Там же, стр. 206.
11. Там же.
----------------------------------------------------------
Поскольку работа велась и с нормальными бактериями, и с их так называемыми гетероморфными гигантскими формами (в противоположность живому лейкоциту последних нетрудно обездвижить в специальных камерах, не нарушая нормального протекания их физиологических процессов, в том числе и деления), можно было сделать несколько последовательных снимков с размножающейся бактериальной клетки л потом, совместив эти негативы, получить эффект Буринского. Результаты были превосходные. Но так как основной негатив и его близнец разделялись слоем стекла, возникла опасность параллакса.
В 1938 г. появилась новая методика, не требовавшая применения пигментных бумаг (12). В основе метода лежало совмещение целлулоидных негативных пленок или неотслоенных желатинных негативов на стеклянных пластинках. Ввиду того что целлулоидные пленки свертываются в трубочку, их труднее совмещать, чем негативы на стеклянной подложке. Работа проводилась с применением штриховых репродукционных пластинок. Для проявления использовался не дающий вуали глициновый проявитель.
При новом методе сначала определяют оптимальную величину экспозиции для получения слегка недодержанного негатива, на котором все детали ясно видны. Проработанный негатив непосредственно печатать нельзя: все детали могут забиться.
Одну кассету заряжают нормально, эмульсией наружу, а в другую вставляют пластинку стеклом наружу. Перед закрыванием крышки кассеты тщательно удаляют всю пыль или грязь со стекла пластинки, так как в противном случае при съемке через стекло в негативе получатся белые точки. Пластинки экспонируют последовательно; вторую пластинку — несколько дольше, так как стекло поглощает часть света. Проявлять пластинки следует одновременно в одной ванночке. Проявление ведут по времени и прерывают его одновременно для обоих негативов. Закрепляют в кислом фиксаже. Затем промывают и сушат.
Высохшие негативы совмещают следующим образом. Поскольку каждый из парных негативов является зеркаль-
-------------------------------------------------
12. М. А. Пешков. Параллельное изучение окрашенного и живого ядра бактерии «Achromobacter epsteinii»,— «Биологический журнал», 1938, т. VII, № 5-6, стр. 1035—1042.
-------------------------------------------------
ным изображением другого, их складывают эмульсионными поверхностями, на одну из которых налит подогретый жидкий раствор канадского или пихтового бальзама на ксилоле. После совмещения двойной негатив кладут для просушки в термостат при +50—60°. Спустя час вынимают и, слегка сдвигая один из негативов, добиваются полного совмещения деталей. Совмещение удобно вести по диффракционным изображениям грязинок в окуляре, имеющих вид концентрических колечек и почти всегда получающихся на микрофотографиях. Затем совмещенный негатив помещают в горизонтальном положении в условиях комнатной температуры на 24 часа. За это время бальзам успевает застыть, и совмещенный цветоделенный негатив готов для получения отпечатков на бромосеребряной бумаге только через увеличитель. Данная методика была впервые применена для демонстрации ядерных образований в живых особях бактерии Achromobacter epsteinii Peshkoff и сразу дала великолепные результаты. Они крайне понравились Живаго, который одобрил дальнейшее применение этого метода в разных областях науки. Методика спаренных негативов вполне оправдала себя в ряде других работ. Наука о клетке видоизменилась. Основное внимание оказалось обращенным на результаты работ с электронным микроскопом. Но наблюдения над живой клеткой, в особенности с применением методов серийной фотографии или микрокинематографии в соединении с цветоделением, не утратили своего значения. Жаль только, что этими вопросами занимаются немногие, да и то недостаточно. Применение метода Буринского, внедренного Живаго в цитологию, дало для кариологии бактерий возможность получить решающие результаты. В трех монографиях, посвященных цитологии бактерий (13), весь основной материал по прижизненному изучению деления бактериального нуклеоида у полиморфной бактерии Achromobacter epsteinii, бактерии Proteus vulgaris и многоклеточных бактерий Caryophanon latum и Caryophanon tenue, а также у сине-
-----------------------------------------------------
13. М. А. Пешков. Полиэнергидные стадии развития бактерий в связи с изменениями их ядерного аппарата. М., 1948; он же. Цитология бактерий. М., 1955; он же. Сравнительная цитология синезеленых водорослей, бактерий и актиномицетов. М., 1966.
-----------------------------------------------------
зеленых водорослей был получен главным образом с применением метода спаренных негативов. Методика цветоделения, введенная Живаго в цитологию задолго до появления способа фазовых контрастов, не всегда дающих удовлетворительные результаты в отношении цитологии бактерий, позволила заглянуть в сокровенные процессы деления бактериального ядра, величина которого составляет доли микрона, и установить те сложные движения, которые свойственны редуплицирующемуся и затем делящемуся нуклеоиду. Метод спаренных негативов был применен Пешковым вместе с физиком МГУ Симановым еще при жизни Живаго к выявлению тонких, еле видимых рентгеновских спектров некоторых соединений. Этот же метод позволил четко показать наряду с солнечной короной полной протяженности хорошо видимый протуберанец. Помимо этого, в эвакуации в Алма-Ате в 1943 г. Пешкову совместно с профессором Б. А. Воронцовым-Вельяминовым удалось получить на фотографии хвост кометы в полтора раза длиннее, чем он выглядел на обычных фотографиях. Наконец, астроном Н. И. Гришин успешно воспользовался этой методикой со ссылками на примеры, полученные Живаго и Пешковым для выявления слабых следов метеоров. Несомненно, цветоделение сыграет большую роль в области электронной микрофотографии, где до сих пор пользуются только методами печати тонко детализированных негативов на бумагах высшей контрастности. Даже совмещение двух позитивов с электроннограммы дало при проекции на экран замечательный результат ясной видимости малоразличимых деталей. Кстати, единственная область, где принцип цветоделения применяется постоянно и без ведома работающих с этими материалами специалистов,— медицинские рентгенограммы. Рентгеновские негативные материалы являются пленками двойного полива. Эмульсия наносится на обе поверхности подложки. Рентгеновские лучи без препятствия проходят через оба слоя, давая два одинаковых и автоматически совмещенных негатива. Эффект Буринского обеспечивает специфические свойства рентгенограмм. В конце 30-х годов Живаго снова возвращается к изучению тонкого строения клетки. В 1938 г. он опубликовал обработанный им и С. Л. Фроловой для печати посмертный материал Б. Н. Шапошникова (умершего в 1920 г.), предложившего новый метод изучения ахроматинового аппарата, и в частности тянущих нитей веретена (14). Сущность метода Шапошникова заключается в сильном и продолжительном (до двух-трех суток) гидролизе освобожденных от парафина гистологических срезов в 30%-ном растворе серной кислоты и последующей окраске их железным гематоксилином Гейденгайна или ализарином с толуидиновой синью по Бенда — Икеда. Для фиксации применялись жидкости Буэна, Жильсона и Карнуа, противопоказаны лишь осмийные смеси. В зависимости от продолжительности гидролиза получается сначала лишь некоторая подчеркнутость «тянущих нитей» при снижении красимости хромосом, которые в конце концов растворяются вовсе. По мере ослабления красимости хромосом способность тянущих нитей совершенно изолированно и интенсивно окрашиваться рядом красителей постепенно возрастает. На основании полученных данных Шапошников высказал предположение, что тянущие нити способны укорачиваться и что им принадлежит главенствующая роль в разведении хромосом к полюсам делящихся клеток. В том же 1938 г. Живаго совместно с К. П. Трухачевой опубликовал исследование, посвященное углубленному изучению тянущих нитей веретена и созданию новой концепции их динамики. Живаго внес в методику, предложенную Шапошниковым, небольшие изменения: обработка серной кислотой, нагретой до 60°, дала возможность сократить ее действие до 40—60 минут. В качестве фиксаторов наряду с выбранными Шапошниковым использовались также жидкость Сан-Феличе и другие хромоформоловые смеси. Кроме того, изменился и объект исследования: Шапошников провел свою работу на сперматоцитах речного рака; Живаго и Трухачева изучали ахроматиновый аппарат в клетках высших растений — боба и лука. Несмотря на различие объектов, были получены весьма близкие фактические данные. Развивая и углубляя взгляды, высказанные Шапошниковым, Живаго сформулировал гипотезу, согласно которой движение хромосом вдоль тянущих нитей управляется силами поверхностного натяжения каплевидно-
---------------------------------------------------
14. Б. Н. Шапошников. Строение митотической фигуры в сперматоцитах речного рака.— «Биологический журнал», 1938, т. VII, № 2, стр. 267.
---------------------------------------------------
го секрета кинетохора, растекающегося вдоль тянущей нити в направлении полюсов веретена. Механизм движения хромосом к полюсам во время телофазы и по сие время еще остается не выясненным. Согласно концепции Шапошникова, опубликованию которой мы обязаны Живаго, и рисункам, сделанным им на основании черновиков Шапошникова, сами тянущие нити, за которые зацепился кинетохор, сокращаясь, подтягивают хромосомы к полюсам. Правда, сейчас известно, что механизм укорочения тянущих нитей не связан с их непосредственным сокращением. Целая серия работ Живаго и его сотрудников, выполненных в 40-х годах, была посвящена изучению ахроматинового аппарата в разнообразных клетках животных самого различного систематического положения. Так, была проведена работа на бластомерах и сперматоцитах аксолотля. Сотрудница Живаго Л. С. Пешковская изучала ахроматиновый аппарат в яйцах аскариды (15) и в клетках полужесткокрылых (16). В работе Пешковской и Живаго объектом исследования были сперматоциты прямокрылых (17). Во всех случаях получены данные, говорящие о принципиальном совпадении тонкого строения ахроматинового аппарата в клетках столь различных животных, хотя обнаружены индивидуальные различия в строении этого аппарата даже у представителей сравнительно близких систематических групп — полужесткокрылых и прямокрылых.
В своих дальнейших исследованиях на животных объектах Живаго обнаружил в анафазе между крупными кинетохорами уже в самом начале расхождения хромосом соединяющий их отрезок нити, соответствующий здесь, как и у растений, «соединительным волокнам» веретена. В работе, посвященной ахроматиновому аппарату, Живаго пишет: «Согласно нашим представлениям это — фибриллы центрального или метафазного веретена, очищаю-
--------------------------------------------------------
15. Л. С. Пешковская. Ахроматиновый аппарат в бластомерах яйца Ascaris megalolocephala bivalens на первых стадиях дробления.— ДАН СССР, 1946, т. 53, № 2, стр. 149-152.
16. Л. С. Пешковская. Ахроматиновый аппарат в сперматогенезе некоторых полужесткокрылых.— ДАН СССР, 1947, т. 58, № 2, стр. 291—294.
17. Л. С. Пешковская, П. И. Живаго. Ахроматиновый аппарат в сперматогенезе некоторых прямокрылых.— ДАН СССР, 1948, т. 59, № 6, стр. 1165-1168.
---------------------------------------------------------
щиеся теперь от собирающихся к полюсам в виде капель отрезков «кинетического футляра». При сравнении картин, наблюдаемых после кислого гидролиза и окраски железным гематоксилином у высших растений и в бластомерах аксолотля, возможны два толкования. У высших растений секретируемые кинетохором капли смачивают одну фибриллу и по ней растекаются. Она обнажается в анафазе в виде «соединительной нити». В бластомерах аксолотля секретируемая кинетохором капля смачивает несколько фибрилл. Само секретируемое нетохором вещество слабосидерофильно, но способность погруженных в него фибрилл удерживать железный гематоксилин достаточно высока. В анафазах бластомеров аксолотля по мере собирания у полюсов полярных отрезков «кинетического футляра» несколько фибрилл, обнажающиеся и смоченные в метакинезе, слипаются между собою, почему здесь и возникает относительно более толстое, чем у высших растений, «соединительное волокно». Вторая возможность сводится к тому, что у высших растений кинетохор также строит «тянущее волокно» на основе нескольких фибрилл, визуальному восприятию которых мешает здесь высокая красимость «кинетического слоя». Наконец, возможно, что число фибрилл, используемых при постройке «тянущих волокон», вообще может варьировать в известных пределах у различных объектов и клеточных типов в зависимости от величины секретируемой кинетохором капли, ее физико-химических свойств и частоты расположения фибрилл в веретене.
Тянущие нити веретен сперматоцитов первого порядка после кислого гидролиза выступают с исключительной резкостью. Вез труда удается установить, что число «тянущих волокон» соответствует числу тетрад. «Тянущая нить» в пределах каждого полуверетена строится здесь, очевидно, двумя кинетохорами диад. Это удвоение числа кинетохоров, обусловливающее и повышение количества растекающегося «футлярного вещества», ведет к значительному утолщению «тянущих волокон» по сравнению с соматическими клетками. При расхождении диад образование между кинетохорами «соединительной нити», т. е. очищение от «футлярного слоя» срединного участка волокна, удается наблюдать здесь с большой ясностью. Срединный участок этот является и в анафазе достаточно массивным. Эта серия работ П. И. Живаго над механизмом действия митотического аппарата, изучавшегося с помощью несколько видоизмененной методики Шапошникова, поставила ряд существенных вопросов, не нашедших своего объяснения и 25 лет спустя. Видимо, очень существенным является факт сохранения «срединного участка», что стоит в определенном противоречии с гипотезой об активной сократимости «тянущих нитей». Интересно отметить, что в последней работе этого цикла подчеркивается необходимость при изучении митозов шире применять прижизненное наблюдение, в частности, усовершенствованный метод фотографического контрастирования. У Живаго снова пробудился интерес к этому перспективному методу, что и нашло отражение в новой серии работ, опубликованных в 1948 г. Лебединой песней Живаго стали его классические исследования прижизненного строения ядрышка. После многолетнего перерыва он вновь применил эту уникальную методику цветоделительного усиления негативов (детали которой описаны выше) к изучению тонкого строения ядрышка, комбинируя ее с рядом других оригинальных методов. «В данной работе,— писал Живаго,— мы пользовались, несколькими методами, для нас уже не новыми. Первый из них связан с известной, но, к сожалению, обычно недооцениваемой цитологами возможностью различать на фотоснимках, подвергаемых специальным обработкам, степени контраста, слишком слабые для непосредственного визуального восприятия. Повторяя и комбинируя эти способы, можно, по нашему опыту, весьма часто повышать эти контрасты до степеней, достаточных для вполне четкого выделения структур, зачастую визуально не воспринимаемых на живых клетках, находящихся в условиях, физиологически достаточно корректных. Второй прием, применявшийся к фиксированным и окрашенным препаратам, состоял в том, что объекты мы заключали не в канадский бальзам, создающий вследствие высокого коэффициента преломления неблагоприятные условия для различения структур, видимость которых основана не на красимости, а на различиях в лучепреломлении, а пользовались столь популярными ранее смесями глицерина с водой, имеющими более низкий коэффициент преломления. Наконец, третий прием состоял в том, что с объектов делался последовательно ряд снимков — оптических разрезов (при апохромате 2 мм, комп. окуляре 8 или 12), причем микрометрический винт микроскопа передвигался в промежутках между каждым снимком на 0,25—0,5 мк. Съемки велись на кинематографических установках с цейтраффером. Таким образом, на кинопленке получается непрерывная протокольная запись всех оптических сечений и, следовательно, всех структур, разрешимых при данной апертуре, для которой (при пользовании видимой частью спектра) 0,25 мк принимается пределом разрешающей способности». Крупное ядрышко из бальбианевского ядра клетки слюнной железы мотыля на этой стадии «сильно вытянуто
в длину и плотно прилежит к одной из хромосом, с которой его плотно соединяет ряд плазматических волокон. При достаточном контрастировании... удается установить, что такое ядрышко имеет дольчатое строение, наподобие огурца, обусловленное наличием и расположением сложной стромы из нитей. Последние представляют скрученные между собой пары... На дистальном по отношению к четвертой хромосоме полюсе ядрышка нити образуют петлю, слипаясь здесь концами или, вероятнее делая поворот назад. Видимо, нити эти представляют хромонемы: их диаметр, оптические свойства и способность к спирализации делают их трудноотличимыми от соответствующих структурных компонентов хромосом тех же клеток. Лишь степень спирализации их в пределах ядрышка, по-видимому, всегда значительно выше» (18). Возникновение ядрышка связано с концами хромонем, покидающих хромосому в дающем его локусе. Вероятнее всего, они делают в пределах филлярной стромы ядрышка, на его дистальном конце петлю и, заворачивая обратно, снова воссоединяются с основным пучком хромонем политенной хромосомы; генез ядрышка, таким образом, сводится в существенном к секреции «основного вещества», сперва, по-видимому, лишь на концах покинувших хромосому хромонем или на месте образуемого ими перегиба. По мере накопления «основного вещества» хромонемы погружаются в него» (19).
Этими классическими исследованиями Живаго открыл новую страницу в науке о клетке и ее ядре, описав спиральную структуру в ядрышке, которая потом, уже после его смерти получила название «нуклеолонемы» (рис. 1 и 2). «Наблюдение фибриллярной структуры ядрышка,— пишет В. Я. Бродский, — попарное соединение спирализованных нитей, их хромосомное происхождение, синтез основного вещества нитчатой структурой были впоследствии подтверждены в десятках исследований, авторы которых не знали о работах Петра Ивановича Живаго» (20).
------------------------------------------------
18. П. И. Живаго. Исследование структуры ядрышек слюнной железы личинок мотыля.— ДАН СССР, 1948, т. 59, № 5, стр. 954.
19. Там же, стр. 956.
20. В. Я. Бродский. Руководство по цитологии, т. I. M., 1965, стр. 310.
