Наибольшее влияние на Д. Н. Прянишникова в период учебы в Московском университете и Петровской академии оказали химик проф. Марковников и ботаник-физиолог проф. Тимирязев. Под влиянием этих ученых Дмитрий Николаевич полюбил химию и физиологию растений. Тимирязев оказал также большое влияние на общественные интересы своего ученика.
В 1892 г. Д. Н. Прянишников едет за границу в научную командировку. За два года своего пребывания за границей он работал у А. Коха (Геттинген), у Дюкло в Париже в Пастеровском институте и у Шульце в Цюрихе. Наибольшее время Дмитрий Николаевич проводит у Шульце. Здесь он выполнил первую работу по азотному обмену в растениях. Шульце со своими сотрудниками много работал над изучением изменения химического состава семян при прорастании. Запасные вещества в семенах при прорастании быстро претерпевают превращения и поэтому семена являются удобными объектами для изучения различных вопросов. Еще в прошлом столетии процесс прорастания подвергался тщательному и всестороннему изучению. Жизнь прорастающего в темноте семени уподоблялась жизни животного. Особенно определенно это было подчеркнуто Буссенго. (1841 г. и др.). При этом Буссенго говорил не только о сходстве, когда дело идет о веществах безазотистых, он проводил аналогию и дальше. Он утверждал, что и в отношении к белковым веществам и продуктам их распада этиолированное растение ведет себя также подобно животному организму. «Животное, - говорит Буссенго, - хотя бы простейшей организации, не ограничивается при дыхании выделением тепла, воды, углекислоты; часть белка, который им потребляется, превращается, благодаря окислительному действию процесса дыхания, в кристаллическое азотистое соединение, мочевину, которое и находят в выделениях. При дыхании растения, живущего в темноте, подобное изменение белка не может быть в той же мере наглядным, так как растения лишены выделительных органов, но в соках, наполняющих клеточки, находят другое кристаллическое начало, аспарагин, который есть также амид, как и мочевина, и который также легко превращается в аспарагиновокислый аммиак, как мочевина превращается в углекислый аммиак. Прорастающее семя или растение, живущее в темном месте, вырабатывает аспарагин. Растение вырабатывает это же тело даже на свету на первых стадиях жизни, пока преобладает потребляющая тенденция, пока растение сжигает больше углерода, чем восстанавливает углекислоты. У растения, выросшего в) темноте, аспарагин накопляется, потому что не происходит процесса его изменения под действием света, его находят в листьях, в стеблях и в корнях, по крайней мере, я в этом убедился, для маиса, бобов, гороха, клевера. Аспарагин несомненно образуется при клеточном сгорании, которое без большого преувеличения можно назвать дыхательным сгоранием. Первоначально семена растений, которые его образуют, не содержат ни малейших следов аспарагина, и не трудно доказать, что растение черпает его составные части только в тех азотистых веществах, которые входят в состав семени.» Но это глубокое проникновение Буссенго в процессы превращения азотистых веществ в растениях не сразу стало общепризнанным. Наоборот, значительно позднее, в 70-х годах прошлого столетия, распространенным оказался противоположный взгляд, защищаемый немецким физиологом Пфеффером. Согласно Пфефферу, аспарагин как кристаллоид, легко проходящий через перепонки, является подвижной формой азотистых веществ семени. В виде аспарагина азотистые вещества быстро передвигаются к растущим частям. В семядолях аспарагин образуется прямо из белка, а в растущих частях он с притекающей глюкозой дает снова белок независимо от действия света. Таким образом, в организме белок расщепляется совершенно иначе, чем при искусственном гидролизе. К этому Пфеффер пришел главным образом на основании микроскопических наблюдений над распределением аспарагина в ростках люпинов, в которых оказалось на первых стадиях мало аспарагина в семядолях и много в корне и стебле и особенно - около конуса нарастания.
В проводящей системе он отсутствует, распределение аспарагина в общем совпадает с распределением тлюкозы в растениях. Пфеффер полагал, что большое распространение аспарагину приписано ошибочно по причине неточности наблюдений. Вопреки Буссенго, Пфеффер придавал значение свету лишь при регенерации аспарагина в белок. Свет, вызывая ассимиляцию, обусловливает накопление материала для регенерации, которая затем может осуществляться и в темноте.
В это время вопросами распространения аспарагина в растениях занимался у нас Бородин (1878 г.). Он проводил исследования также микроскопическим методом. При этом он разработал методы выделения аспарагина, тирозина и др. Бородин установил, что аспарагин находится не только в проростках, но имеет более широкое распространение. Много аспарагина им было обнаружено в этиолированных побегах деревьев, в побегах из корневищ. Он пришел к выводу, что аспарагин постоянно образуется в растении и регенерируется в белок, если имеются углеводы. При обычных условиях роста поэтому аспарагин и не открывается.
Если же поставить растение в условия, при которых в нем запасные углеводы будут использованы, а ассимиляция их затруднена, то аспарагин будет накопляться в больших количествах. Однако в поставленном им интересном опыте с ветвью сирени после ее затенения происходило накопление аспарагина, хотя приток углеводов не был нарушен. Усовершенствованный микроскопический метод Бородина, к сожалению, не давал возможности открывать глютамин, встречающийся вместе с аспарагином. На основании микроскопического обнаружения аспарагина трудно было судить о распаде белков.
Для изучения процесса распада белков при прорастания семян Е. Шульце (1876 г. и др.) применил метод качественного и количественного химического исследования. Это было шагом вперед как в изучении процесса прорастания семян, так и вообще в изучении обмена в растениях и животных. Самим Шульце и его учениками был накоплен большой материал о ходе процесса прорастания у разных растений. В ростках люпина кроме преобладающего в них аспарагина найден лейцин, тирозин и аргинин. Эти исследования показали, что при распаде белков в растении и при искусственном распаде получаются те же продукты, но количественные соотношения продуктов распада различны. Особенность растений откладывает свой отпечаток на количественные соотношения продуктов распада. Далее оказалось, что в некоторых растениях аспарагин может быть замещен близким к нему глютамином.
Лясковский (1874 г.) при изучении прорастания тыквенных семян обнаружил, что они содержат амид, разрушаемый кипячением с соляной кислотой, но выделить аспарагин в кристаллах из ростков не удается. На основании своих исследований он заключил, что энергия образования аспарагина связана с энергией дыхания. В свою очередь то и другое зависит от температуры.
В работах Шульце показано, что аспарагин в тыквенных семенах замещен глютамином, который сопровождается лейцином, тирозином, аргинином.
На основании качественного сходства продуктов искусственного распада белка с продуктами распада в прорастающих семенах Шульце делает заклю чение, что процесс распада в обоих случаях проходит одинаково и если имеют место различия в количественных соотношениях продуктов распада, то это объясняется вторичными причинами - различной скоростью потребления продуктов распада на построение новых частиц белка. Аспарагин в люпинах накопляется с первых же дней прорастания, когда еще не исчезли углеводы. В ростках на долю аспарагина приходится гораздо большая часть азота, чем в семядолях. Все это приводит Шульце к выводу, что аспарагин труднее регенерируется в белок, чем другие продукты распада.
Но и это не могло объяснить большого накопления аспарагина при прорастании. Тогда Шульце делает второе предположение, что некоторые продукты распада, распадаясь далее, превращаются в аспарагин. Для того, чтобы подкрепить предположение о тождественности процесса распада белков в растении с искусственным разрушением белков, Шульце делает в дальнейшем новые предположения, а именно, что лейцин, тирозин, фениламидопропионовая кислота являются главными первичными продуктами разрушения белков, которые далее распадаются, выделяя азотистые остатки; последние путем синтеза с безазотистыми веществами, например, в яблочной и янтарной кислотами дают аспаратин. Все амидосоединения в этиолированном растении являются согласно предположению Шульце результатом синтеза первоначальных продуктов глубокого распада белков.
Еще в статье 1878 г. Шульце высказался за образование аспарагина за счет других продуктов распада белковых веществ: «Так как мы не можем принять, - говорит он, - что резервные белковые вещества распадаются в начале прорастания совершенно иным способом, чем в его позднейших стадиях, то должно заключить, что в ростках аспарагин образуется за счет продуктов распада белковых веществ». Однако в дальнейшем, как мы видели выше, Шульце уклонился от этого пути под влиянием господствовавших в то время воззрений и только постепенно по мере накопления новых фактов у него самого и у его учеников он стал развивать свой первоначальный тезис об аспарагине.
Работы Шульце и его учеников вызвали большой интерес к азотному обмену в растениях. О. Мюллер опубликовал (1886 г.) специальную работу по аспарагину, к которой пытался выяснить значение углеводов и света для регенерации белка из аспарагина. Для этого он затенял часть растения, не удаляя ее от материнского растения, как это делал Бородин, чтобы не нарушалось снабжение углеводов. Во всех опытах наблюдалось образование аспарагина в затененных частях.
В других опытах часть растения лишалась углекислоты, но оставалась освещенной. И при этих условиях испытанные растения накопляли аспарагин в органах, лишенных усвоения углекислоты. Работы Бородина и Мюллера говорят о том, что именно в растущих органах происходит накопление аспарагина. Палладии в своей работе (1889 г.) по влиянию кислорода на распадение белковых веществ в растении приходит к выводу, что теория Пфеффера не имеет за себя никаких данных. Аспарагин по Палладину образуется в процессе окисления. При помещении ростков в бескислородную атмосферу образование аспарагина прекращается. Но распадение белков в проростках совершается с большой энергией и в бескислородной среде. Этот взгляд Палладина на связь образования аспарагина с окислительными процессами оспаривался, но позднее был подтвержден Годлевским (1903 г.).
Таким образом, в 90-х годах прошлого столетия, когда Д. Н. Прянишников включился в исследования по азотному обмену, картина была такова: продолжало господствовать представление Пфеффера по азотному обмену и роли аспарагина в растениях, хотя ни одна работа, выполненная по этому вопросу, не подтверждала правильности взглядов Пфеффера. Наоборот, работы Бородина, Мюллера и особенно работы Шульце и его учеников говорили против представления Пфеффера и получали объяснение при принятии взгляда Буссенго. Работа Шульце была проведена над люпинами, семена которых отличаются богатством белковых веществ и малым содержанием углеводов. Дмитрий Николаевич поставил перед собой задачу проследить с количественной стороны ход распада белков в семенах, богатых углеводами, чтобы выяснить отношение белков и углеводов друг к другу при прорастании, - как последовательно накопляются разные группы амидосоединений, как они распределяются по растению.
Объектом изучения взята была Vicia sativa, семена которой содержат около 40% углеводов. Часть этой работы проведена Д. Н. Прянишниковым в Цюрихе в лаборатории Шульце в 1893-1894 гг., закончена она была в 1895 г. в бывшей Петровской, ныне Тимирязевской сельскохозяйственной академии.
За 40 дней пребывания проростков вики в темноте периодически проводились исследования расхода органических веществ на дыхание, убыль крахмала, увеличение клетчатки, распад белков с образованием аспарагина и аминокислот. При прорастании семян вики содержание белка сначала резко падает, затем уменьшение его замедляется. При графическом изображении почти зеркальным отображением кривой распада белка является кривая образования суммы аминокислот и амидов. Кривая образования аспарагина показывает, что количество его со временем увеличивается, и он становится главной составной частью небелкового азота, накопляющегося при прорастании. В конце опыта на долю, аспарагина приходилось две трети азота от общего количества его в аминокислотах и амидах. В исходном белке на долю аспаратиновой кислоты приходилось 3% от всего азота; а в проростках на 40-й день азот аспарагина составлял уже 42%.
На основании этих данных Д. Н. Прянишников делает естественный вывод, что аспарагин не является первичным продуктом распада белка, как это утверждал Пфеффер, а образуется в результате вторичных процессов. В семенах вики содержится много крахмала и, несмотря на это, с первых же дней идет накопление аспарагина и значит он не используется проростками на синтез белка, как это следовало по Пфефферу.
Полученные данные заставили Дмитрия Николаевича окончательно отказаться от взглядов Пфеффеpa и признать аспарагин вторичным продуктом обмена веществ, подобным мочевине, образующейся путем вторичного синтеза за счет аммиака.
В своей первой работе с викой в 1894 г. Д. Н. Прянишников писал: «Невольно вспоминается взгляд Буссенго, по которому аспарагин в этиолированных ростках является таким же продуктом окисления белков (продуктом гидролиза белков), как мочевина в животном организме; как аспарагин, так и мочевина не могут быть потреблены в процессе регенерации белка, но в то время как мочевина удаляется из организма, аспарагин накопляется в клеточном соке этиолированных растений. Но когда под влиянием света в растении берут верх синтетические процессы, тогда кончается аналогия с животным организмом», аспарагин потребляется растением в процессе синтеза белков.
Окончательное доказательство образования аспарагина путем вторичного синтеза дано было Дмитрием Николаевичем (1897 г.) в Москве в опытах с горохом, викой и желтым люпином. Он проследил путем ежедневных анализов суточный ход распада белка и образования аспарагина с одновременным учетом энергии дыхания. Опыты позволили ему сделать ряд выводов. Процесс распадения белковых веществ характеризуется своего рода большой кривой. Ход накопления аспарагина выражается подобной же кривой. Максимум кривой аспарагина лежит близко к максимуму распада белка. Обе кривые достигают наиболее высоких точек на несколько дней раньше чем кривая выделения углекислоты. В конце периода прорастания энергия накопления аспарагина превышает скорость распада белков, то есть во второй половине прорастания, в его нисходящей части «аспарагиновая кривая» (увеличение аспарагина), идет выше «белковой кривой» (распад белка). Это говорит о том, что в конце периода прорастания аспарагина образуется больше, чем распадается белка, и аспарагин создается не только за счет белка, а и за счет других азотистых веществ.
Такими азотистыми веществами являются аминокислоты; аспарагин, следовательно, образуется вторичным путем, а это возможно лишь в том случае, если в ростках и в тканях животного организма аминокислоты распадаются с образованием аммиака и этот аммиак потребляется в процессе синтеза аспарагина. Из молекулы любой аминокислоты не может получиться молекула аспарагина, содержащая две группы NH2. Для этого необходимо, чтобы распалась другая молекула аминокислоты и этот аммиак в таком случае может пойти на образование амидной группы. Установление вторичного происхождения аспарагина позволило Дмитрию Николаевичу преодолеть противоречия, которые существовали во взглядах на процесс распада белков при прорастании. Шульце считал этот процесс гидролитическим, а Палладин и Лев (1889 г.) - окислительным. Под влиянием фермента в семядолях белок распадается путем гидролиза так же, как это происходит при кислотном гидролизе. В растущих органах зятем продукты гидролиза могут окисляться с образованием аммиака, который при вторичном синтезе используется для образования аспарагина.
Блестящее разрешение вопроса об аспарагине дало возможность Д. Н. Прянишникову правильно понять и вопрос об аммиаке, как источнике азота растений. В самом деле, «если аммиак, - говорит Дмитрий Николаевич, - образовавшийся при регрессивном метаморфозе, растение может использовать для нового синтеза, то отсюда нужно было заключить, что и извне поступающий аммиак тоже может потребляться растением непосредственно без предварительной нитрификации».
В новом издании своего учебника - физиология растений - в 1897 г. Пфеффер считал мнение Прянишникова о сходстве между аспарагином и мочевиной «во всяком случае ошибочным». Однако в дальнейшем не только собственные работы Дмитрия Николаевича подтвердили взгляд на аспарагин как аналог мочевины, образующийся путем вторичного синтеза, но это было подтверждено и рядом других работ в том числе и в лаборатории Пфеффера, его преемником Руляндом. Аспарагин является носителем группы NH2, которая используется растением в целях синтеза. Поэтому аспарагин в этом смысле представляет собой резервное вещество, но не транспортную форму резервных азотистых веществ семядолей, как полагал Пфеффер, так как он и образуется не в семядолях, а в растущих стеблевых органах.
В опубликованной недавно (1938 г.) монографии по азотному обмену в растениях Чибнелл подробно излагает работы по аспарагину и те условия, при которых Д. Н. Прянишникову удалось разрешить вопрос о синтезе аспарагина. «Лет за пять, - указывает Чибнелл. - до появления работы Шульце, являющейся результатом его долгих и упорных исследований, Прянишников уже совершенно точно установил, что часть аспаратана в проростках должна происходить из продуктов разложения белка. Основываясь на собственных данных и на данных ученика Шульце-Мерлиса (1897 г.), Прянишников путем сравнения интенсивности разложения белка, с одной стороны, и интенсивности накопления аспарагина, с другой, установил, что оба процесса достигают своего максимума приблизительно в одно и то же время, но затем процесс разложения белка понижается значительно быстрее процесса накопления аспарагина. Это показывает что аспарагин синтезируется из других продуктов распадения белка, и таковыми, по предложению Прянишникова, должны быть аминокислоты.» Чибнелл при этом отмечает, что в 90-х годах прошлого века «такое предположение являлось теоретическим, и сам Шульце, без сомнения, считал его таковым. В то время анализы белка были еще далеко не полными (около 45% - то есть неполный количественный учет продуктов-гидролиза) и не было еще доказательства того, что при энзимном и даже кислотном гидролизе молекула белка дает только аминокислоты».
На основании синтеза аспарагина Д. Н. Прянишников считал несомненным усвоение аммиака растением через корни, но прямых доказательств не было. Однако ждать этого пришлось недолго. В 1897 г. Коссович провел такие» исследования и в 1901 г. опубликовал их результаты. В 1900 г. по этому же вопросу опубликованы были исследования Мазе (Maze). Вопрос этот давно подвергался обсуждению и еще Либих считал аммиачные соли даже единственным источником азота для растений. Другие же исследователи наоборот полагали, что селит ра является единственным источником азота для растений. Начинай с 60-х годов прошлого столетия ряд исследователей пытался с применением водных культур, а также стерилизации почв решить этот вопрос, но безупречно проведенных исследований не было. Коссович и Maze при изучении этого вопроса применили стерильные культуры. Коссович в стерильных песчаных культурах с горохом, а Maze в стерильных водных культурах с маисом вполне убедительно показали возможность использования аммиака растениями в качестве источника азота и то, что Д. Н. Прянишников считал a priori несомненным, в работе Коссовича и Maze нашло экспериментальное решение. ... Шульце не раз высказывался положительно по этому вопросу. Так, в работе 1898 г. он пишет: «Что при превращении вещества в ростках продукты распада белковых веществ подвергаются расщеплению, ведущему к образованию аммиака, это следует признать возможным - тем более, что присутствие аммиачных солей в ростках уже обнаружено».
Однако участие аммиака в образовании аспарагина экспериментально не было установлено, и Пфеффер (1897 г.) писал в своем учебнике - физиологии растений, что «в высших растениях распад белковых веществ, повидимому, вообще приводит лишь к образованию амидов. Образование некоторого количества аммиака в ростках вероятно, но не установлено точно».
На основании своих работ по превращению азотистых веществ в растениях Дмитрий Николаевич пришел к выводу о безусловном участии аммиака в образовании аспарагина. Однако это заключение было только логическим следствием из накопления аспарагина в проростках при соответствующем уменьшении аминокислот. Предполагалось, что этот аммиак находится в растении в скрытом виде, вследствие того, что он по мере образования быстро потребляется в процессе синтеза аспарагина.
Решение этого вопроса выпало на долю В. С. Буткевича (1904 г.), крупного физиолога и микробиолога, работавшего в течение ряда лет в лаборатории акад. Д. Н. Прянишникова по азотному обмену в растениях. Буткевич, разбирая вышеприведенное замечание Шульце об образовании аммиака в растениях, пишет, что «присутствие некоторого количества аммиака в ростках еще не позволяет непосредственно заключить о том, что аммиак образуется в них путем распада первичных продуктов расщепления белковых веществ; возможно, что и аммиак является продуктом первичного гидролитического расщепления». При выяснении поставленного вопроса необходимо, по мнению Буткевича, «решить: 1) может ли аммиак, доставляемый извне, служить материалом для образования в нем аспарагина (или глютамина) и 2) влечет ли за собой устранение или ограничение возможности образования этого амида в растении, накопление в последнем аммиака». Первый вопрос нашел свое разрешение, что же касается второго вопроса, поставленного Буткевичем, то можно сказать, что не имелось никаких данных, которые послужили бы основанием для решения его в том или ином направлении.
В основание своих опытов Буткевичем была положена мысль Клода Бернара (1878 г.). Эта мысль заключалась в том, что путем воздействия на организм некоторыми веществами происходящие в нем процессы могут быть диференцированы, то есть некоторые процессы могут быть приостановлены, тогда как другие будут продолжать свое течение. Так, по мнению К. Бернара, действие анестезирующих веществ на процессы обмена в организме сводится к тому, что они, не задерживая реакций регрессивного метаморфоза, приостанавливают организованные, синтетические процессы. Исходя из этой мысли, Буткевич воспользовался таким односторонним воздействием, как средством освобождения реакций регрессивного метаморфоза от осложняющих их в нормально функционирующем организме синтетических процессов и для решения вопроса об образовании в высших растениях аммиака, в качестве одного из конечных продуктов совершающегося в них превращения азотистых веществ. Если Шульце и Прянишников правы, то в подвергнутых анестезии проростках - думал Буткевич - можно ожидать накопления аммиака. В качестве анестезирующего средства был применен толуол. Опыты проводились в присутствии кислорода и в отсутствии его. Проведено несколько серий опытов. Во всех случаях в присутствии кислорода толуол вызвал анестезию проростков различных растений и как следствие этого - накопление аммиака. Отсутствие кислорода сильно снижает накопление аммиака. Опыты с анестезией дают основание для предположения о том, что первичные продукты распада белковых веществ в растении претерпевают расщепление с образованием аммиака, который, входя в соединение с другими находящимися в растении группами, дает аспарагин. В бескислородной среде аммиак не образуется. Это показывает, что образование аммиака связано с окислительными процессами. В других опытах Буткевич ростки люпина дольше обычного выдерживал в темноте (без анестезии), доводя растение до сильного углеводного голодания. Этот прием также позволил обнаружить накопление аммиака в растениях. Буткевич (1912 г.), далее, испытал питание глюкозой проростков люпинов после значительного голодания. Как мы видели выше, лутем голодания люпина в темноте Буткевичу удалось наблюдать образование аммиака у проростков. Питанием глюкозой удалось уменьшить образование аммиака. Таким образом, оказалось возможным прояснить эту картину превращений с помощью двух приемов, именно анестезии и голодания.
Раньше было известно, что низшие организмы и животные ткани способны доводить распад белков до аминокислот и дальше до аммиака, причем, например, в плесневых грибях аммиака может накопиться значительное количество. Работы Буткевича установили, что и высшие растения в отношении образования аммиака при распаде белковых веществ не являются исключением среди различных групп организмов, только в высших растениях, как и у животных, эта способность ясно проявляется лишь в особых аномальных условиях. В нормально же функционирующем растительном организме благодаря быстрому потреблению аммиака на синтез аспарагина удается обнаружить только незначи тельные количества аммиака.
Буткевич выяснил и условия накопления аммиака в грибах. Так у Aspergillus при питании белками накопление аммиака идет параллельно с образующейся щавелевой кислотой, которая нейтрализует аммиак. При искусственном устранении кислотности введением в среду мела Aspergillus замедляет накопление аммиака, ограничиваясь расщеплением белка до аминокислот. Penicillium и Mucor мало образуют кислот, и они соответственно образуют мало аммиака и много аминосоединений. При искусственном введении в окружающую среду фосфорной кислоты эти организмы начинают превращать азотистые вещества до аммиака, который образуется ими до тех пор пока реакция остается кислой.
Если аммиак самого растения быстро используется в процессе синтеза амидов, то вероятно и поступающий в растение аммиак извне также должен пойти на образование аспарагина и глютамина и в этой обезвреженной форме представлять собой запас для синтеза различных аминокислот. Для выяснения этого вопроса Д. Н. Прянишников со своими сотрудниками предпринял целую серию опытов с проростками в темноте. Нужно отметить, что попытки выяснить этот вопрос были и раньше, но считать вопрос решенным было нельзя. В 1895 г. опубликована работа Kinoshita (ученика О. Лева) об образовании аспарагина из нитратов и аммиачных солей явнобрачными. Этиолированные ростки ячменя выращивались в песке с дестиллированной зодой, с 1 % раствором хлористого аммония и с раствором селитры. Согласно автору, растения, получившие аммиачную соль, не содержали аммиака в тканях, и анализ их показал увеличение аспарагина. Автор приходит к выводу, что в темноте аммиак может служить материалом для образования аспарагина. Дмитрий Николаевич подробно останавливается на этой работе в своей диссертации (1899 г.) и приходит к выводу, что отсутствие определений аммиака является важным дефектом работы. Азот аспарагина определяется по количеству отогнанного аммиака, поэтому данные аспарагина представляют на самом деле сумму аспарагинового и аммиачного азота. Следующие работы из той же лаборатории вышли в 1897 и 1898 гг. Автор: этих работ Suzuki также считает возможным синтез амидосоединений из аммиака и нитратов в темноте. Однако и здесь отсутствуют определения аммиака и количество аспарагина получается преувеличенным. Только в опыте с гречихой, где не было прироста аспарагина, сделаны количественные определения аммиака. Аммиак был найден, и автор полагает, что в этом случае растениям нехватало углеводов для образования аспарагина. В опытах с нитратами также, хотя и в меньшем количестве, наблюдалось образование аспарагина. В опытах с аммиаком и нитратами в темноте образования белков не констатировано.
Укажем также на работы Годлевского (1897 г.) с этиолированными проростками пшеницы. Опыты Годлевским повторялись в 1903 г. и снова им были получены положительные результаты в отношении синтеза азотистых органических соединений в темноте на нитратах. Наконец, представляется необходимым указать на работу Залесского (1898 г.), показавшего образование белковых веществ за счет продуктов их распада при прорастании в темноте луковиц Allium Сера, данные которого подтверждены в одной из рабт Д. Н. Прянишникова. Опыты Годлевского и Залесского представляют собой первые исследования, в которых с необходимой строгостью показано образование органических азотистых соединений у этиолированных растений.
В работах Д. Н. Прянишникова и его сотрудников были взяты различные растения, с разным запасом в них углеводов, с различной стадией развития проростков. При таком систематическом проведении исследований результаты опытов позволили разделить все исследуемые растения на три группы:
1. В опытах с зерновыми злаками при питании растворами аммиачных солей (0,05-0,1% NH4Cl) в проростках легко образуется аспарагин; аммиак при этом не накопляется.
2. У гороха, вики введение в раствор солей аммония с сильными кислотами не вызывает увеличения содержания аспарагина, в проростках или даже наблюдается его уменьшение в связи с подавлением роста и замедлением распада белков; при введении в раствор СаСО3 начинается использование аммиака в процессе образования аспарагина.
3. У люпина обычно, а у других растений при крайнем истощении запаса углеводов даже введение СаСО3 не вызывает синтеза аспарагина и проростки страдают от аммиачного отравления.
В опытах Шулова (Прянишников и Шулов, 1910 г.) этиолированные проростки гороха и ячменя выращивались на десталлированной воде и на 0,1 растворе NH4Cl. У гороха аспарагин за счет аммиака не образовался. Хлористый аммоний даже задержал развитие проростков и потому меньше белка распалось и меньше образовалось аспаратина. Опыты с ячменем дали совершенно другие результаты. Здесь под вшиянием аммиачной соли имело место увеличение процента общего азота и азота аспарагина, а также заметное увеличение и содержания аммиака. В другой серии опытов с горохом в питательный субстрат кроме хлористого аммония вносился и СаСО3 или CaSO4. В обоих случаях соли кальция привели к повышению содержания, аспарагина в проростках гороха. Опыты показывают, что особенность растения играет существенную роль в образовании органических азотистых соединений и что соли кальция могут иметь большое значение в создании благоприятных условий для образования аспарагина из поглощенного аммиака. Такие же результаты как и с ячменем получены Перитуриным (1912 г.) в опытах с проростками тыквы. Расчет поглощения аммиака и образования из него-аспарагина дал возможность притти к выводу, что одна половина аммиака идет на образование амидной труппы, а другая половина - на образование амминной группы и сделать вывод, что аспарагин образуется не только путем вторичного синтеза проростками, но он является и первым продуктом синтеза при усвоении аммиака, поступающего извне. Однако для образования аспарагина из аммиака, поступающего из питательного раствора, необходимо, чтобы в растении имелся какой-то безазотистый остаток, получающийся за счет углеводов.
Таким образом, устанавливается тесная связь между отношением проростков к поступающему из раствора аммиаку и содержанием углеводов) в прорастающих семенах. Насколько существенно наличие углеводов в семенах, видно из опыта Шулова (1912 г.) с люпином. Введение в растение аммиачных солей подавляло у люпина синтез аспарагина за счет собственного аммиака, имело место накопление аммиака в растениях и введение СаСО3 не исправляло положения.
Эти результаты оптребовали в свою очередь выяснения вопроса: в чем здесь дело, в углеводах или каких-либо других видовых отличиях. Для выяснения этого вопроса поступили следующим образом. В первых опытах (Смирнов А. И., 1914 г.) у ячменя был удален эндосперм или обеднение углеводами достигалось более длительным выращиванием проростков в темноте. В обоих случаях при дальнейшем введении в раствор аммиачных солей ячмень вел себя подобно люпину - в проростках накапливался аммиак, а не аспарагин. Наоборот, если у люпина увеличивали содержание углеводов, помещая ростки на свет или давая глюкозу в темноте в стерильных условиях (Смирнов А. И., 1918 г.), тогда в проростках люпина увеличивалось количество аспарагина и уменьшалось содержание аммиака. Если же росток люпина поместить на свету, но не дать СО2 (опыты под стеклянными колпаками), тогда при отсутствии глюкозы люпин вел себя так же, как и в темноте, хотя ростки и отличались морфологически. Опыты показали, что решающим фактором в синтезе аспарагина являются углеводы, а не свет. ... На основании имеющихся данных Дмитрий Николаевич еще в 1916 г. дал итоговую формулировку роли аммиака «аммиак есть альфа и омега, в обмене азотистых веществ у растений, то есть с него начинается синтез, им кончается распад и снова он вовлекается в круговорот, если есть налицо безазотистый материал. Свет для синтеза аспарагина не нужен, но синтез белков идет главным образом на свету за счет как аминокислот, так и амидов». Правда, сотрудником Д. Н. Прянишникова - Г. Г. Петровым (1918 г.) в стерильных культурах при питании кукурузы глюкозой и аммиаком показано было наличие синтеза белка в темноте, но, как отмечает и Дмитрий Николаевич, количественно это выражается весьма небольшими цифрами.
Основные выводы из исследований по азотному обмену в растениях Д. Н. Прянишников выразил в виде кругового процесса. Правая половина круга отвечает процессам распада, происходящим в темноте, а левая - процессам синтеза (преобладание) на свету. Белок как исходный материал при распаде и конечный продукт при синтезе объединяет обе половины круга. Звездочкой отмечен скрытый аммиак. Аспарагин назван им обезвреженным аммиаком.
Исследования в области животной физиологии показали, что низшие животные доводят распад белков до аммиака и не превращают его в амиды, а выделяют его. Чем выше стоит животное по организации, тем меньшую непосредственную роль играет аммиак среди продуктов распада белков и большее значение приобретают амидные группы. Исследования Иванова Н. Н. (1928 г.) показали, что и некоторые бесхлорофильные растения обезвреживают аммиак путем образования мочевины, которая может накапливаться у них в значительных количествах. Введением аммиака извне можно вызвать у грибов образование мочевины, а введением глюкозы - уменьшить количество мочевины. Грибы, следовательно, по способности сжигать углеродную цепочку до углекислоты близки к животным организмам. Черты сходства обмена у животных и растений можно наблюдать и в синтезе. Давно уже осуществлены исследования по введению в кровеносную систему печени кетокислоты и оксикислоты. С аммиаком они образовали соответствующие аминокислоты, а продуктом промежуточным являлись иминокислоты.
Как мы видели выше, Д. Н. Прянишников в первой же работе высказался по вопросу об аспарагине в растениях против господствующего взгляда, развиваемого Пфеффером. Последующие работы Дмитрия Николаевича и многих других исследователей по этому вопросу дали обильный материал против взглядов Пфеффера, однако новый взгляд на роль аспарагина стал общепризнанным только значительно позднее. Интересно, что преемник Пфеффера по кафедре проф. Рулянд организовал у себя целую серию работ по азотному обмену в листьях различных растений. Эти работы подтвердили взгляд на образование аспарагина и глютамина и растениях. Как правило, в высших растениях обезвреживание аммиака достигается путем образования амидов аминокислот, но имеются и исключения для растений с очень кислым клеточным соком (Saurepflanzen или Ammoniakpflanzen по Ruhland und Wetzel, 1926 г.) и способных накоплять еще больше кислот при поступлении аммиака (для связывания аммиака в виде аммиачных солей органических кислот).
Дальнейшие работы лаборатории Рулянда (Kultzscher, 1932 г.) показали, что между «аммиачными» и «амидными» растениями существуют и переходные формы. Деление растений на «аммиачную» и «амидную» группы не имеет смысла, но важно учитывать, что различное рН клеточного сока у растений вызывает определенные изменения в азотном обмене. Отношение амиднаго азота к аммиачному является низким у растений с очень кислым клеточным соком (рН 1,2-3,5 Begonia, некоторые виды Rumex и Geranium). Некоторые виды Geranium имеют рН клеточного сока 4-5 и по отношению амидного азота к аммиачному занимают промежуточное положение. У большинства же растений с клеточным соком, обладающим рН 5-б, имеет место преобладание амидного азота над аммиачным. Чем кислее клеточный сок у растения, тем менее оно наклонно к образованию амидов и наоборот. Листья растения с кислым клеточным соком легко выдерживают такие количества аммиака в растворе, от которого другие растения определенно страдают аммиачным отравлением. Интересно, что при питании листьев «аммиачных» растений аспарагином они не склонны к накоплению амидов, а разрушают их с освобождением аммиака. В лаборатории Д. Н. Прянишникова в опытах Кашеваровой еще в 1914 г. проростки люпина развивались на воде с добавкой различных дозировок серной кислоты. Чем выше была взята доза серной кислоты, тем больше в проростках найдено аммиака и меньше аспарагина, то есть в данном случае подкислением клеточного сока «амидное» растение превращалось до известной степени в «аммиачное».
Известно, что растения были подразделены исследователями на две группы - одна группа при распаде белков накопляет аспарагин, а другая - глютамин. Это деление было основано на качественном методе кристаллизации.
В дальнейшем вместо качественного метода кристаллизации стали применять более совершенный количественный метод, основанный на гидролизе аспарагина и глютамина при различных рН раствора (аспаратин гидролизуется при кипячении раствора, имеющего рН ниже 3, а глютамин - при рН около 6,5). При применении количественного метода определения аспарагина и глютамина было обнаружено, что деление растений на «аспарагино-вые» и «глютаминовые» строго провести нельзя, а может итти речь о преобладании того или иного амида в зависимости от исследуемого органа растения (Schwab, 1936 г.)- Соотношение между аспарагином и глютамином может изменяться в одном и том же органе в зависимости от условий роста растения. Относительно благоприятные условия роста приводят к большему накоплению глютамина, а при большей трате энергетического материала накопляется преимущественно аспарагин. Глютамин при этом может быть источником для образования аспарагина. Так, в опытах Mothes'a (1940 г.) с голодающими листьями в начале опыта глютамин преобладал над аспарагином, но затем по мере ухудшения углеводного баланса наступает уменьшение глютамина, а количество аспаратина продолжает повышаться. Та же картина наблюдается и при введении глютаминовокиелого аммония в листья ржи после некоторого голодания. Сначала идет энергичный синтез глютамина, а затем начинается задержка его накопления, а синтез аспарагина продолжается. После длительного голодания начинает ослабевать и накопление аспарагина, образование же аммиака сильно возрастает.
Д. Н. Прянишникова интересовало выяснение вопроса о путях связывания аммиака в растении с безазотистыми соединениями. Еще в 1910 г. он писал: «Если оказывается, что весь ассимилированный аммиак перешел в аспарагин, то отсюда следует заключить, что одна половина аммиака переходит в группу CHNH2, а другая в группу CONH2 и что аспарагин образуется не из аспарагиновой кислоты, образующейся в небольших количествах при гидролитическом распаде белка, а например, из яблочной или фумаровой кислоты, вообще из безазотистых веществ и аммиака». Вскоре после этого (1912 г.) он в качестве предположения давал следующие схемы связывания аммиака:
Яблочная кислота - аспарагиновая кислота - аспарагиновокислый аммоний - аспарагин.
Лишь значительно позднее выяснилось, что главная роль принадлежит непредельным кислотам и кетокислотам, которые являются продуктами окисления углеводов. Из непредельных кислот фумаровая кислота прямым присоединением аммиака дает аспарагиновую кислоту. Реакция эта обратима и вызывается ферментом аспартазой. Кетокислоты с аммиаком дают иминокислоты, которые при восстановлении образуют соответствующие аминокислоты. Оксалоуксусная кислота образует при этом аспарагин, а кетоглутаровая кислота - глютамин. Эти реакции обратимы и вызываются ферментом гидротеназой. Оксалоуксусная кислота получается окислением яблочной, а яблочная, отдавая воду, дает фумаровую кислоту. Последняя может получиться из янтарной отнятием двух атомов водорода. Таким образом, янтарная, фумаровая, яблочная и оксалоуксусная кислоты связаны между собой взаимными превращениями и играют прямую или косвенную роль в образовании аспарагиновой кислоты. Что из кетоглутаровой кислоты образуется глютамин, было экспериментально установлено Chibnall (1939 г.). Он инфильтрировал аммиачную соль кетоглутаровой кислоты в листья райграса и наблюдал затем убыль кетоглутаровой кислоты и прирост глютамина.
Д. Н. Прянишников называет дикарбоновые кислоты - фумаровую, оксалоуксусную и кетоглутаровую - специфическими уловителями аммиака, который обезвреживается, потребляясь в процессе образования аминокислот, а также амидов аминокислот. Амиды аминокислот образуются из аммиачных солей аспарагиновой и глютаминовой кислст путем дегидратации, вызываемой специфическими ферментами.
Chibnall отмечает быстрое образование глютамина и в листьях райграса в полевых условиях. На другой день после внесения в почву значительных количеств сернокислого аммония на кончиках листьев выступил белый налет, состоящий из кристаллов глютамина. После выяснения этого в листья райграса был инфильтрирован глютаминовокислый аммоний. Через 22 часа в листьях уменьшение количества аммиака точно совпало с количеством образовавшегося амидного азота. В опытах Vickery с сотрудниками (1933 г.) листья табака помещались черенками в воду в темноте и на свету. В темноте образуется немного глютамина и в большом количестве - аспарагин. В дальнейшем содержание глютамина резко понижается, задерживается образование аспарагина и быстро возрастает количество аммиака.
Такой же опыт на свету показывает накопление не только аспарагина, но и глютамина. В результате своих исследований по азотному обмену Mothes приходит к заключению, что образование амидов связано не только с обезвреживанием аммиака в растениях, но этим достигается также стабилизация аминной группы аспарагиновой и глютаминовой кислот, имеющих важное значение в жизни растений.
Когда Дмитрий Николаевич изобразил схему азотного обмена в растениях в виде кругового процесса (1926 г.), ему пришлось поставить в схеме две звездочки, обозначающие скрытое участие аммиака в восходящей части при переходе от амидов к аминокислотам и в нисходящей части - при переходе от аминокислот к амидам. Скрытое участие аммиака при переходе от аминного азота к амидному было установлено вышеупомянутыми опытами с анестезией, проведенными В. С. Буткевичем. Что же касается перехода от амидного азота к аминному, то при создании схемы было ясно участие аммиака, но механизм этого перехода не был вскрыт. Лишь значительно позднее наши биохимики Браунштейн и Крицман (1937 г. и др.), изучая биохимические процессы в животном организме, открыли переход аминной группы аспарагиновой или глютаминовой кислоты к любой кетокислоте. Кетокислоты с одной карбоксильной группой несклонны непосредственно реагировать с аммиаком и давать аминокислоты, которые превращаются затем в аминокислоты. Однако эта реакция с аммиаком легко осуществляется с оксалоуксусной и кетоглутаровой - дикарбоновыми кислотами. При этом получаются аспарагиновая и глютаминовая кислоты, которые способны передавать аминогруппу другим кетокислотам. Таким образом, через аспарагиновую и глютаминовую кислоты лежит путь синтеза разнообразных аминокислот. Этот процесс перехода аминной группы дикарбоновых кислот к другим кетокислотам Браунштейн и Крицман назвали «переаминированием». Процесс «переаминирования» Браунштейн и Крицман обнаружили при проведении исследований с животными тканями, но «переаминирование» имеет значение и для растительных организмов и это было быстро установлено. Так, в опытах Virtanen и Laine (см. Чибнелл, 1939 г.) растертая масса гороха вызывала реакцию «переаминирования» между аспарагиновой кислотой и кетокислотами. Euler с сотрудниками обнаружили, что глютаминовая кислота, внесенная в вытяжки из различных растений, благодаря содержащимся в них ферментам, становится донатором группы NH2 и способствует синтезу аминокислот.
Рассмотрение вопроса о роли дикарбоновых кислот Д. Н. Прянишников в своей монографии (Азот в жизни растений и в земледелии СССР, 1945 г.) заканчивает следующими словами: «Итак, дикарбоновые кислоты и их амиды играют троякую роль в обмене азотистых веществ:
1) они являются формой обезвреживания того аммиака, который образуется при регрессивном метаморфозе азотистых веществ, особенно резко выраженном при прорастании; 2) при процессе синтеза азотистых веществ за счет аммиака, поступающего извне, они являются первыми продуктами синтеза, одновременно служат, как для обезвреживания этого аммиака, так и для образования резервов группы NH2, которая послужит для синтеза аминокислот и белков, когда растение будет располагать достаточным количеством углеводов; кроме резервирования группы NH2, дикарбоновые аминокислоты непосредственно участвуют в механизме ее передачи, вступая в реакции переаминирования с различными кетокислотами и тем способствуя синтезу непосредственных компонентов белковой молекулы».
Дальше в монографии излагается гипотеза Виртанена, по которой в механизме фиксации азота клубеньковыми бактериями главная роль принадлежит реакции между оксалоуксусной кислотой и гидроксиламином.
«Если, - говорит Дмитрий Николаевич, - эта гипотеза подтвердится, то этим добавится еще одна важная сторона участия дикарбоновых кислот в процессах обмена азотистых веществ в растении.»
Вопрос об аммиаке представляет интерес не только с точки зрения выяснения биохимизма азота в растениях, но и с точки зрения непосредственного использования аммиака в сельском хозяйстве. Выяснение роли аммиака в азотном обмене представляет собой основу, на которой строятся наши представления об особенности аммиачного и нитратного питания и разрабатываются практические мероприятия эффективного применения аммиачных и нитратных удобрений под различные культуры. В этом направлении лабораторией Д. Н. Прянишникова проведено много исследований.
Попытки выяснить вопрос об использовании растениями нитратов предпринимались еще в прошлом столетии. В 1900 г. опубликована работа Годлевского, в которой приведены опыты с этиолированными растениями, показывающими использование ими нитратов для синтеза азотистых органических соединений. В 1912-1915 гг. в опытах с проростками различных растений в темноте сотрудниками Дмитрия Николаевича (Перитурин, Калинкин, Ритмам) обнаружено образование аспарагина по нитратам так же, как и за счет аммиака, только количественно синтез аспарагина по нитратам выражен был слабее, чем по аммиаку. Эти опыты сделали вероятным предположение, что образованию аминного и амидного азота и при нитратном питании предшествует образование аммиака.
Развертывая эти исследования, Д. Н. Прянишников (1919 г.) в опытах с проростками гороха поставил такой вопрос: не вызывает ли подкислеяие раствора изменения в отношении растения к поглощению аммиака и нитратов из азотнокислого аммония, а именно перехода от преимущественного поглощения аммиака к преимущественному поглощению азотной кислоты? Подкисление раствора давало это изменение, но при сильном подкислении подавлялся синтез, амидов за счет аммиака, однако образование аммиака за счет нитратов продолжалось и это приводило к выделению аммиака растениями в окружающий корни раствор. Эти работы скоро нашли подтверждение в опытах Костычева и Цветковой (1920 г.) и Warburg und Negelein (1920 г.). В опытах Костычева и Цветковой плесневым грибам в качестве источника азота давался NaNO3. При достаточном обеспечении углеводами образование белков происходило без накопления промежуточных продуктов, но при пониженном питании сахаром в растворе появлялись нитриты и аммиак. Эти исследования впервые дали возможность установить основные этапы превращения нитратов плесневыми грибами. Опыты Warburg und Negelein проводились с одноклеточной водорослью Chlorella. В раствор вводилась смесь NaNO3+HNO3. При хорошем освещении имел место энергичный синтез белков и накопления аммиака не происходило. При ослаблении ассимиляции путем затенения в растворе появлялся аммиак, а иногда и нитриты, образовавшиеся за счет редукции нитратов.
Продолжение исследований в лаборатории Д. Н. Прянишникова по разбираемому вопросу мы видим в опытах Дикусара И. Г. (1924 г.). Опыты проводились с этиолированными растениями, в качестве источника азота в раствор был введен NaNO2. Основной вывод из опытов таков: чем меньше запас углеводов у проростков, тем скорее обнаруживается аммиак, как промежуточный продукт перехода от окисленного минерального азота к органическим азотистым соединениям. У горчицы аммиак появлялся скорее чем у вики, более богатой углеводами. Повышение концентрации нитритнота азота в растворе ускоряет образование аммиачного азота.
В последующих опытах Смирнова и Ерыгина (1926 г.) с проростками вики и при нитритном источнике азота определение содержания различных форм азота в растениях показало, что аммиак образуется в результате восстановления нитритов, а не вследствие процессов дезамидирования и дезаминирования.
Опыты с детальным изучением поступления и превращения нитратов в томатах проведены Eckerson (1924 г.). Растения были пересажены из почвы в кварцевый песок и выдержаны в нем без азота в течение двух недель. После такой подготовки проведен анализ растений, который показал отсутствие в них нитратов, нитритов, аммиака и аминокислот. Затем в песок внесен Ca(NO3)2 и через определенные интервалы проводился микрохи мический анализ срезов растений. Через 24 часа нитраты были обнаружены во всех частях растений, а верхушки некоторых растений давали слабую реакцию на нитриты, но аммиака еще не было. Через 36 часов во всех растениях найдены нитриты и следы аммиака. В следующий срок анализа (48 часов) заметно меньше было нитритов и больше аммиака. При обработке срезов абсолютным спиртом обнаружены кристаллы аспарагина. В дальнейшем наблюдалось сильное увеличение количества аминокислот и появление янтарной и яблочной кислот.
В работе Klein und Kisser (1925 г.) показано, что даже у ассимилирующих растений увеличением дозы нитратов можно вызвать образование нитритов и аммиака, чего в обычных условиях не наблюдается.
При дальнейшем исследовании вопроса о восстановлении нитратов, возник вопрос о локализации этого процесса в растениях. Nightingale и Schermerhorn (1928 г.) на Нью-Джерсейской опытной станции провели работу со спаржей и пришли к выводу, что в ее мочковатых корнях уже происходит восстановление нитратов. При этом сначала образуются нитриты и аммиак, а затем - аспарагин и аминокислоты. Восстановление нитратов сопровождается значительной тратой углеводов. Там же - на Нью-Джерсейской опытной станции Tiegjens и Blake (1932 г.) в опыте с яблоней показали, что мелкие корневые разветвления деревьев являются главными органами, где происходит ассимиляция нитратов и аммиака. При высоких же дозах нитратного азота в корнях может иехватить углеводов и тогда (Burstrom, 1937 г.) значительная часть нитратов переходит в надземные органы и там ассимилируется растениями.
Таким образом, установлено, что нитраты в растениях восстанавливаются до нитритов и затем до аммиака. Давно уже в литературе имелись указания, что при переходе NO2 в 1МНз образуются промежуточные соединения. Так, еще в 1896 г. Бах А. Н. полагал, что главная роль в восстановлении нитратов в растительном организме выпадает на долю формальдегида. Переход от азота азотной кислоты к аммиачному азоту может происходить путем простого отщепления кислорода без последующей гидрогенизации азота. При этом азотная кислота последовательно переходит в азотистую и азотноватистую. Дальнейшее отщепление кислорода должно привести к двухвалентному радикалу - NH, который с элементами воды образует гидроксиламин. Последний с формальдегидом дает формальдоксим, который путем простого интрамолекулярного перемещения образует формамид. Последний может служить исходным материалом для синтеза азотистых соединений в растениях. Но, как мы видели выше, нитраты могут восстанавливаться и в корнях растений, где имеются углеводы и нет формальдегида. Затем, в опытах Лемуань (Lemoigne, 1937 г.) сок листьев сирени вызывал быстрое восстановление нитритов и образование гидроксиламина. Предполагая, что в этой реакции принимает участие аскорбиновая кислота, в опыте вместо сока сирени взяли слабый раствор аскорбиновой кислоты. И в этом случае имело место образование гидроксиламина. Михлин (1938 г.) в опытах с водорослью Chlorella и с высшими растениями пытался установить образование гидроксиламина. У водоросли удалось наблюдать образование гидроксиламина за счет нитратов, а у высших растений это оказалось возможным только при введении в растение формальдегида, который, очевидно, связывает гидроксиламин в виде оксима.
Образование гидроксиламина при восстановлен нии нитратов и нитритов констатировано и в ряде работ с микроорганизмами. Наконец, следует отметить, что на основании опытов с микроорганизмами доказывается наличие другого члена между нитритами и аммиаком - гипонитритов - солей азотноватистой кислоты. Этот промежуточный член ctohi ближе к нитритам, чем гидроксиламин. Таким образом, наши представления о превращении азотистых соединений в растительных организмах в результате отмеченных исследований стали значительно полнее.
Эффективное использование растениями нитратного и аммиачного азота зависит от целого ряда сопутствующих факторов. Выяснение роли этих факторов и было предметом многочисленных исследований как самого Д. Н. Прянишникова, так и его сотрудников. Эти работы послужили физиологическим обоснованием успешного применения аммиачных и нитратных удобрений. Эта большая тема увлекла и многих других исследователей, в резуль тате чего мы имели большое количество работ по этому вопросу. Просматривая работы по аммиачному и нитратному питанию за сравнительно большой отрезок времени, естественно сталкиваемся в ряде случаев с противоречивыми данными. Усовершенствование методики исследования во многих случаях позволило устранить эти противоречия и найти решение вопроса.
Физиологическая кислотность аммиачных солей может оказать вредное действие на рост растений. Если это так, то смена раствора окажет положительное действие. Это и показано убедительно в работе Бобко и Соколовой (1918 г.) с ячменем и горохом. В дальнейших опытах (Логвиновой и др.) показано, что физиологическая кислотность проявляется весьма быстро, особенно если раствор аммиачной соли дается предварительно выросшему растению.
Опыты по сравнению эффекта аммиачного и нитратного азота привели к необходимости установления определенных градаций рН питательного раствора (Купренок, 1924 г.). Оптимум для нитратной серии оказался иным, чем для серии аммиачной, и падение урожая при переходе от оптимума в щелочную и кислую сторону более резко наблюдалось для аммиачной серии. В обычных водных культурах, однако, трудно регулировать рН раствора - получаются значительные сдвиги от заданного интервала рН, поэтому в последующих опытах при решении этого вопроса перешли к текучим культурам.
В опытах Дикусара (1926 г.) с сахарной свеклой в текучих культурах определенно выявилось различное положение оптимума рН при аммиачном и нитратном источнике азота. При нейтральной реакции аммиак в качестве источника азота дал лучшие результаты, чем нитраты, а при кислой реакции получились обратные результаты. В последующем опыты с сахарной свеклой и капустой привели к тем же результатам, как и первые опыты с сахарной свеклой. Анализ растений показал, что при кислой реакции растения, питавшиеся аммиаком, содержали значительно меньше кальция, чем при нитратном питании. После этого был поставлен опыт с различными дозами кальция на фоне различных интервалов рН и аммиачного и нитратного источника азота. Повышение содержания кальция в питательном растворе при аммиачном источнике азота резко повысило урожай сахарной свеклы, а в случае нитратов, наоборот, произошло понижение урожая. Антагонизм Са:Н был отмечен Д. Н. Прянишниковым еще в 1923 г., а в этом опыте наглядно показан антагонизм NH4:Ca. Необходимость увеличения количества кальция в питательном растворе при замене нитратного азота на аммиачный была констатирована затем в ряде опытов (Демиденко, 1934 г.). Эти опыты показали, насколько важно иметь в питательной смеси Прянишникова (1902 г.) при замене половины нитратного азота на аммиачный достаточное количество растворимой соли кальция. О различном отношении растений к рН раствора в зависимости от источника азота было затем проведено большое количество опытов за границей (Pirschle, 1931 г., Naftel, 1931 г., Tiedjeens and Robbins, 1931 г., и др.) и у нас и все они в общем подтвердили результаты, полученные в лаборатории Д. Н. Прянишникова.
Исследования аммиачного и нитратного питания растений привели Дмитрия Николаевича к необходимости изучения их при сочетании в одной соли NH4 и NO3.
Еще в 1900 г. он назвал эту соль «удобрением будущего». Это предположение полностью оправдалось. У нас в СССР и в ряде других стран эта соль занимает ведущее положение среди азотных удобрений. Этой соли в лаборатории Д. Н. Прянишникова дана детальная физиологическая характеристика. В результате исследований эта соль получила характеристику как физиологически кислая соль. Этим и объяснялось ее растворяющее влияние на фосфорит в песчаных культурах. Причем физиологическая кислотность проявилась и при кислой реакции среды. Еще при разработке питательной смеси Прянишникова (1902 г.) буферное действие проявлялось при комбинации NH4NO3 только с основными фосфатами, а при комбинировании NH4NО3+КН2РО4 растения страдали от кислой реакции. Для того, чтобы избежать нитрификации, наблюдения над поглощением аммиака и нитратов Шуловым И. С. (1912 г.) проводились в стерильных условиях. Относительно большее поглощения аммиака имело место пои кислой реакции, создаваемой комбинацией солей NH4NO3 + КН2РО4. После этого (1917-1919 гг.) было проведено наблюдение над поглощением этиолированными проростками ячменя и гороха аммиака и нитратов из NH4NO3 при разных степенях кислотности среды. Заключение из указанных опытов было таково, что в пределах нормального роста растений NH4NO3 является всегда физиологически кислой солью, амфотерное положение ее связано уже с патологическими явлениями.
При изучении адсорбции растительными клетками растворенных веществ и в частности NH4NO3: Д. А. Сабининым (1922 г.) в кратковременных опытах с проростками пшеницы показана зависимость поглощения NH4 и NO3 от реакции среды.
В дальнейшем в лаборатории Д. Н. Прянишникова продолжались исследования с целью получения детальной характеристики азотнокислого аммония. Этому способствовала разработка методики определения рН, а также появление в литературе исследований по поглощению аммиака и нитратов растениями, в которых авторами получены были иные результаты.
Так, у Pantanelli (1915 г.) в кратковременных опытах на свету проростки бобовых из раствора NH4NO3 поглощали больше аниона, чем катиона. То же получено и в опыте с сульфатом аммония. Эти результаты противоречили результатам исследования Дмитрия Николаевича, и он провел специально для выяснения этого вопроса опыты с злаковыми w бобовыми на свету и в темноте, при разной степени: истощения проростков, при различной концентрации NH4NO3 и при разной реакции среды. У ростков, обедненных углеводами, имело место относительно более сильное поглощение нитратов по сравнению с аммиаком, то есть в этих опытах получились результаты, согласные с результатами Pantanelli.
На основании своего большого опыта и результатов исследований других авторов Д. Н. Прянишников объясняет это тем, что недостаток углеводов раньше подавляет синтез амидов, чем редукцию нитратов. У свеклы с малым запасом в семенах углеводов это явление наступает раньше, чем у гороха. При кислой реакции явление перехода от поглощения аммиака к его выделению происходит скорее, чем при нейтральной реакции. Для окончательного выяснения вопроса об условиях преимущественного поглощения аммиака или нитратов по предложению Дмитрия Николаевича, Ивановой В. С. (1928-1931 гг.) были проведены опыты с одной нитратной формой азота в растворе, (NaNO3) при разных степенях рН и при разном возрасте проростков или иначе при разном запасе углеводов в них. В опытах наблюдалось поглощение NO3 и выделение NH3 и тем более энергичное, чем больше раствор содержал NaNO3. Процесс восстановления нитратов продолжается до последних стадий истощения растений. Можно даже наблюдать случаи совпадения количества поглощенных нитратов и образования аммиака. За этим пределом истощения наступают уже процессы дезаминирования и дезамидирования и растения погибают от аммиачного отравления. Таким образом, уменьшение запасов углеводов в растении приводит к последовательному выключению синтеза органических азотистых соединений, начиная с выключения наиболее сложного процесса синтеза белков и кончая выключением синтеза амидов. При нарушении синтеза некоторое время может еще продолжаться наиболее простой процесс восстановление нитратов до аммиака, но так как синтез нарушен, то образующийся аммиак выделяется наружу в раствор. ... Глубокий анализ явлений, происходящий при питании растений аммиачным и нитратным азотом, проведенный Дмитрием Николаевичем, позволил ему дать исчерпывающее объяснение результатам исследований ряда авторов по этим вопросам. Так, Naftel (1931 г.) и Stahl и Shive (1935 г.) на основании своих опытов с ассимилирующими растениями (хлопчатник, овес, гречиха) пришли к выводу, что на первых стадиях развития растения поглощают преимущественно аммиак, а на более поздних стадиях (после цветения) нитраты. В ряде опытов в лаборатории Д. Н. Прянишникова показано, что такие результаты могут быть получены при высокой дозе азота (80-240 мг N на 1 л в текучих культурах), при которой возможен перекорм азотом в виде NH4NO3. Кроме прямого поступления аммиака из этой соли возможно образование аммиака за счет редукции нитратов. Этот процесс сильно должен сказаться именно после цветения, когда потребность в азоте снижается и если благодаря избытку аммиак не мог быть потреблен в процессах синтеза, то и должна получиться видимость большего поглощения нитратов, чем аммиака.
В лаборатории Д. Н. Прянишникова много внимания было уделено изучению сравнительного действия аммиачного (восстановленной формы азота) и нитратного (окисленной формы азота) питания на качество урожая.
Для примера мы приведем данные с кок-сагызом и махоркой. В опытах у Калинкевича (1938 г.) при аммиачном источнике азота содержание каучука в корнях кок-сагыза было значительно выше, чем при нитратном источнике азота. Это находит свое объяснение в том, что при восстановлении нитратов в растении возможно окисление веществ, из которых оно создает восстановленное соединение - каучук. В опытах Владимирова (1939 г.) при тех же источниках азота сумма сахаров была значительно выше по аммиачному источнику азота, а содержание лимонной кислоты, наоборот, выше по нитратному источнику азота. Полученные результаты связаны, очевидно, с окислительными процессами в растениях при восстановлении нитратов. Дмитрием Николаевичем и его сотрудниками было уделено внимание вопросу влияния сопутствующих катионов (Са, К, Mg) на поглощение аммиака и нитратов и на рост растений. Большие исследования по этому вопросу проведены были также Tsund Lee-Loo (1931 г.), из которых видно, что ион кальция снижает поступление NO3 и поглощение аммония превалирует над нитратами и, наоборот, введение калия в раствор положительно сказывается на поглощении нитратов из NH4NO3.
Однако влияние кальция и калия изучалось здесь на фоне сложной питательной смеси. В лаборатории Д. Н. Прянишникова (1943 т.) проведены опыты с проростками кукурузы и пшеницы, в которых испытывалась последовательная замена кальция калием при постоянном количестве хлора, сульфата или фосфата. На этом фоне вносилось определенное количество NH4NO3. Во всех случаях получилась совершенно определенная картина положительного действия кальция на поглощение аммония и калия - на поглощение нитратов.
В дальнейших опытах (Туркова, 1944-1945 гг.), кроме учета поглощения аммония и нитратов, изучались также и изменения в обмене азотистых веществ. При этом учитывалось накопление в растении амидов, аминокислот и белкового азота. Опыты проводились с ассимилирующими проростками пшеницы. Увеличение отношения Са:К в растворе с NH4NO3 повышало относительное содержание белкового азота (в процентах от общего азота) и в то же время увеличивало накопление амидов. Содержание аминокислот наоборот возрастало с повышением отношения К:Са. Таким образом, изменение соотношения Са:К в растворе приводит не только к изменению поглощения растением NH4 и NO3 из NH4NO3, но и оказывает определенные изменения в накоплении азотистых веществ. Обычно NH4NO3 ведет себя как физиологически кислая соль и преимущественное поглощение нитратов имеет место только при явно кислой реакции (рН 4,0 и ниже), неблагоприятной для развития растений. Но если раствор содержит набор катионов, способствующих поглощению нитратов, то более энергичное поглощение нитратов возможно и при слабо кислой реакции (рН 5.0-6.0), при которой не может иметь места патологических изменений в обмене веществ.
По этому же вопросу выполнен ряд исследований. Ответим некоторые из них. Любарская Л. С. (1933 г.) проводила кратковременные опыты с аммиачным и нитратным питанием зеленых проростков сахарной свеклы. Совместное внесение аммиачного азота с КСl повышало поступление аммиачного азота и использование его растением на образование белкового и аминокислотного азота. КСl оказал положительное действие и на ассимиляцию нитратов, но это действие несколько отлично от внесения его с аммиачной формой азота.
Турчин (1936 г.) на основании своих опытов с дозами фосфора и калия при аммиачном и нитратном источнике азота приходит к выводу о противоположном характере действия фосфора и калия на окислительно-восстановительные процессы в растениях. Для фосфора характерно усиление восстановительных процессов, а для калия - усиление окислительных процессов. Это обстоятельство находит свое отражение и при аммиачном и нитратном питании.
В лаборатории Д. Н. Прянишникова в вегетационных опытах Гулякина И. В. (1940 г.) с сахарной свеклой показана высокая чувствительность растений к уменьшению калия при сравнительно высокой дозе азота, внесенного главным образом в виде NH4NO3. Понижение калия в августе сильно снижало содержание сахара в корне и повышало сот держание небелкового азота в листьях.
Переходя от физиологических особенностей аммиачного и нитратного питания к их агрономической оценке, Дмитрий Николаевич говорит, что при оптимальных для каждого источника азота условиях они с физиологической стороны равноценны между собой, если же они сравниваются при иных условиях, то преимущество будет на стороне одного или другого источника азота. Учитывая же практические условия сельского хозяйства, агроному легче иметь дело с нитратной формой азота. Однако промышленность дает сельскому хозяйству по ряду причин азот главным образом в аммиачной форме, поэтому при агрохимических исследованиях необходимо глубоко разобраться в тех взаимоотношениях почвы, удобрения и растения, которые складываются на практике в сельском хозяйстве. Это позволит добиться эффективного использования аммиачных удобрений. В качестве примера глубокого решения вопроса можно привести работу Д. Н. Прянишникова с сахарной свеклой, в которой показана чувствительность проростков этой культуры к аммиачному удобрению, вследствие малых запасов углеводов в ее семенах. Это соответственно сказывается на технике применения азотных удобрений.
Исследования по азотному обмену проходят красной нитью через всю долголетнюю работу Дмитрия Николаевича. Но наряду с этим Дмитрием Николаевичем и его сотрудниками проведены многочисленные исследования по фосфатному и калийному питанию, а также по многим другим вопросам. Уже один перечень статей (см. т. XVI - Из результатов вегетационных опытов и лабораторных работ под ред. Д. Н. Прянишникова) по этим вопросам показывает научное и практическое значение работ Д. Н. Прянишникова и его лаборатории и в этой области. Однако в данном обзоре мы ограничиваемся рассмотрением работ по азотному вопросу.
Как видим, Д. Н. Прянишников уделял большое внимание исследованиям по азотному вопросу. Результаты этих исследований служили биохимической и физиологической основой для агрохимического решения вопросов, связанных с использованием азотных удобрений. Это дало возможность Дмитрию Николаевичу овладеть азотным вопросом в целом, то есть не только в выяснении роли азота в жизни растений, но и в земледелии. И последняя часть его монографии по азоту содержит исключительно интересный и важный материал, касающийся роли азота в земледелии. И в этой области Д. Н. Прянишников в течение долгих лет занимал и занимает ведущую роль как ученый-физиолог, агрохимик и агроном, внесший много ценного в решение азотного вопроса в земледелии нашей страны.
