Задача рассказать о трудах Д. Н. Прянишникова в области биологической химии выпала мне — представителю биохимии животных организмов и медицинской химии. Другие, более компетентные ученые расскажут о заслугах Дмитрия Николаевича в агрохимии, которые всем известны и пользуются самой высокой оценкой как в Советском Союзе, так и во всем мире. Важнейшие труды жизни Дмитрия Николаевича касались обмена и превращения азотистых веществ в растениях, а «мало явлений, в которых так ясно определяется взаимная роль теории и практики, как в тех исследованиях, в которых изучены вопросы о происхождении азота в растениях, неразрывно сливаясь с чисто практическими вопросами». Это слова К. А. Тимирязева, сказанные более 55 лет тому назад.
И нет работ о белковом обмене зеленых растений, в которых автору не приходилось бы писать широко о трудах Дмитрия Николаевича. Назовем Викери (Vickery) — во многих трудах, Чибнэл (Chibnall) — в изданной накануне войны монографии о белковом обмене растений. Характерно, что труды Прянишникова как бы росли в глазах современников. Еще в фундаментальной монографии Чапек (Czapek 1920) они цитируются с несомненным признанием в большом списке других исследований. С развитием понимания основных биохимических процессов в растениях, животных и микроорганизмах оценка трудов Прянишникова поднялась; они вполне вььдержали испытание временем. В монографиях посвящены отдельные главы трудам Дмитрия Николаевича, являющимся основой, на которой другие строят свои экспериментальные и теоретические работы.
Биохимические работы Прянишникова относятся к вопросу — как и из чего образуются аспарагин и глутамин; это два амида дикарбонных аминокислот, которые с самого начала фитохимии бросаются в глаза своим обилием в молодых растениях, своей доступностью в химической обработке и прекрасной кристаллизацией — подобным образом, как мочевина, мочевая кислота и гиппуровая кислота — в химии животных. И эти две аминокислоты — аспарагиновая и глутаминовая, — происхождение которых в высших растениях выяснили труды Дмитрия Николаевича, в последнем десятилетии благодаря исследованиям молодого поколения советских ученых находятся в центре обмена белковых аминокислот. А. Е. Браунштейн прав, когда говорит об общей интегрирующей функции аминодикарбонных кислот в обмене азотистых веществ.
Развитие биохимии продвигается в каждом отдельном вопросе по следующей эволюционной линии:
1. Открытие составной части организма, ее химическое выяснение.
2. Попытки выяснения ее происхождения и дальнейшей судьбы методом «химической дедукции». Химическая дедукция — это предположения, основанные на обсуждении формулы и на аналогии с лабораторными опытами синтеза и превращения. Эти итоги оказывались почти всегда ошибочными, но с них и начинается наше мышление, — другого пути нет.
3. Наблюдения физиологических колебаний в содержании данного вещества в организмах и над колебаниями в содержании тех веществ, с которыми мы их связываем на основании химической дедукции. Эти наблюдения дают возможность проверить в некоторой степени правильность или ошибочность нашей гипотезы.
4. Физиологические эксперименты, которые изменяют и биологический объект, и вещества, подвергающиеся превращению: они разрешают нам расширить и уточнить итоги, которые вытекают из названных выше (в пункте 3) наблюдений и ведут к новым итогам.
5. Разделение превращений данного вещества на первичные реакции, открытие промежуточных продуктов, восстановление (из уравнений первичных реакций) балансов образования и распада изучаемых веществ, выделение каталитических факторов, которые участвуют в первичных реакциях.
Названные этапы ведут к осуществлению того, что сформулировал 60 лет тому назад друг Дмитрия Николаевича — Шульце (Schultze, 1885 г.), как задачу физиологической химии:
«Понимать обмен, происходящий в организмах, путем идентифицирования его с химическими процессами, которые можно осуществить вне организмов.»
Труды Дмитрия Николаевича сосредоточились, как уже было сказано, на вопросе, как образуются и какую роль играют аспарагин и глутамин в азотистом обмене высших растений, и в дальнейшем — на еще более фундаментальном вопросе — минерального соединения азота, поступающего в организм растений, входящего затем в состав органических азотистых веществ. После открытия аспарагина (1806 г.) и аспарагиновои кислоты (1833 г.), но до выяснения структуры аспарагиновои кислоты (1866 г.) и аспарагина (1887 г.), образование аспарагина в прорастающем растении было установлено аптекарем Меничи в Пизе и химикам Пирия (1844 г.). Я говорю об открытии, что в прорастающих семенах вики появляется, независимо от света, аспарагин, которого нет в семенах и нет в зрелом растении. После этого открытия ростки бомбовых растений стали классическим объектом исследования азотистого обмена растений. Назовем вкратце труды классика в этой области — Буссенго (Boussingault), в которых доказано, что в ростках в темноте происходит окисление с уменьшением массы вообще, массы крахмала и жиров, образование сахаров и целлюлозы, без изменения количества азота, который из белкового состояния переходит в аспарагин. Здесь была замечена аналогия между образованием мочевины у животного и аспарагина в растениях (1862 г.).
Открытие Буссенго, что общий азот в семенах кукурузы не изменяется в процессах прорастания, было исходным пунктом трудов Пфеффера (Pfeffer), учение которого долго господствовало в физиологии азотистого обмена. Пфеффер понимал азотистый обмен ростков как превращение макромолекулярных белков семян в подвижный (диффундирующий) аспарагин и др. аминокислоты. Эти продукты являются, по его мнению, подвижным материалом, источником азота, из которого в тканях ростков образуются, при участии сахаров, новые белки. Исследования Пфеффера не были обоснованы точным количественным определением баланса азота — и это была их слабая сторона. В то время, до конца XIX века, понятия о строении белков, об аминокислотном их составе, о постоянстве аминокислот и их изменчивости были очень далеки от того, что мы о них знаем в настоящее время.
Ученым, который замечательно способствовал выяснению белковых аминокислот и одновременно доследованию обмена в растениях, являлся Эрнест Шульце, профессор в Цюрихе. В своих исследованиях азотистого обмена в прорастающих растениях Шульце применял количественный метод в определении судьбы отдельных азотистых веществ. Основным итогом его исследований является то, что белки семян подвергаются энзиматическому превращению, которое ведет к накоплению амидов дикарбонных аминокислот. Но огромные количества аспарагина и глутамина, находящиеся в тканях таких растений, не могут происходить непосредственно из аминокислот. Они должны образоваться из аммиака, полученного путем дезаминирования других аминокислот при участии безазотистых веществ, возможно — сахаров. Шульце было доказано, что в форме этих двух амидов находится в ростках больше азота, чем соответствует количеству его, образующемуся из аминокислот.
На этом этапе начинаются работы Прянишникова. В 1892 г. Дмитрий Николаевич был командирован за границу и после некоторых попыток найти себе подходящее место для работы в одном из крупнейших центров он остановился в Цюрихе у Эрнеста Шульце и, как говорит Дмитрий Николаевич, «ему не приходилось жаловаться». Несомненно не приходилось жаловаться и Шульце. Дмитрий Николаевич включился в работу этой тихой, замечательной и сосредоточенной лаборатории, в которой уже много работало русских, и он со своей стороны внес в эту школу высокую научную культуру русской физиологии растений: он вышел из школы К. А. Тимирязева. Прянишников внес в исследования азотистого обмена столько свежей инициативы, оригинальности и смелости фронтального наступления на трудные вопросы, что немедленно многие из них приблизились к разрешению. Дмитрий Николаевич оказался скоро общепризнанным авторитетом в этой области. Трудам, которые начал Шульце по линии выше определенной (3), Прянишников дал новый сдвиг и привел к развитию тот этап, который мы определили как (4).
Шульце таким же образом, как и до него Буссенго, Пфеффер, Бородин, наблюдал и изучал все более полными и тонкими аналитическими методами химические явления в прорастающем растении. Прянишников приступил к химическому эксперименту, в том смысле, как его, начиная с Клод Бернара (Claude Bernard), применяют в физиологии животных организмов, изменению условий явления и экспериментальному изменению биологического объекта.
Прежним экспериментальным данным и толкованиям Пряншшшков подвел итоги, указав, что аспарагин является в обмене растений вторичным продуктом белкового обмена, подобно тому, как мочевина в обмене животного организма. Мочевина образуется в печени из аммиака, который появляется в результате пищеварительных и гнилостных процессов в кишечнике; она образуется в печени из аминокислот возможно путями, которые предупреждают выделение аммиака в форме аммонийных ионов.
В 1895 г. Дмитрий Николаевич показал экспериментальным путем, что аспарагин не может быть непосредственным продуктом превращения белка или содержащихся в нем аминокислот.
Он также высказал свое мнение, что несомненно весь второй азот (и в большей мере первый) происходит из аммиака, который освобождается в процессе дезаминирования.
Мы не будем придерживаться хронологического порядка появления в печати работ Дмитрия Николаевича, а перейдем к его творчеству после возвращения из Цюриха в Москву — к трудам его и его учеников. Мысль Дмитрия Николаевича уже тогда ясно показала, что образование аспарагина в ростках требует аммиака и сахара. Эти факторы заняли место (менее точно определенных) белков и продуктов их превращения и «безазотистого вещества» прежних исследователей. Доказать это удалось Дмитрию Николаевичу прямым экспериментом. Ростки ячменя в растворе 1 % NH4 и Сl накопляли (при сохранении того же содержания белков) на 20 мг аспарагинового азота больше, чем то же самое число (100) ростков в воде. Подобным образом горох, который прорастает в присутствии аммонийных солей и сульфата кальция, накопляет органический азот, который на 90% является азотом аспарагина.
Эти же отношения были доказаны позднее для синтеза глутамина в свекле. Глутамин и аспарагин мы считаем промежуточными акцепторами и донаторами аминных групп в обмене.
После открытия синтеза аспарагина в растениях роль этого вещества отделилась от обмена белка в ростках и оказалась делом, не зависимым от распада и синтеза белков, и более общим фактором в азотистом обмене растений.
Доказательство, что высшее растение может превращать аспарагин и глутамин в аммиак, выяснило, какое именно минеральное соединение азота входит непосредственно в синтез органических азотистых соединений в обмене растений.
30 лет тому назад Дмитрий Николаевич высказал, что: «Аммиак является альфой и омегой обмена азотистых веществ как в растительных организмах, так и в животных». Аммиак — через аспарагин, мы сегодня лучше скажем — через аспарагиновую кислоту. Центральную роль аммиака в обмене растений Дмитрий Николаевич представил в схеме.
Прянишников подчеркнул роль амидов дикарбоновых кислот, как вещества, синтез которого связывает два атома азота и которое при этом безвредно. Этот синтез является детоксикацией, но детоксикацией, связанной с образованием запасов. Здесь ясная аналогия с образованием мочевины в печени высшего животного, в грибах, грибках и проч., разница только в том, что мочевина в организме животного является окончательным экскреторным продуктом, азот которого для каталитических срдеств животного организма заблокирован. В то же время аспзрагин является запасным веществом, азот которого может поступить опять в белковые аминокислоты. Аспарагин и глутамин являются нейтральными и безвредными промежуточными запасами белкового и углеводного обмена.
Здесь надо обратить внимание на то, что из двух аминодикарбоновых кислот одна (аспарагиновая кислота) выступает в больших количествах в виде амида, другая (глутаминовая) является большей частью (до 42%) запасных белков злаков и (до 24 %) казенное молока. И в этих белках они находятся в виде амидов. Здесь кажется, две формы запасов, причем свободные амиды растений являются запасными первой очередности.
Самой прекрасной частью трудов Дмитрия Николаевича над синтезом аспарагина в ростках является экспериментальная расшифровка факторов, от которых синтез зависит, — овладение этими факторами в такой мере, что на основании экспериментов можно было доказать общий характер этого синтеза.
Растения, над которыми производились эксперименты до момента этих работ, распадались на несколько групп в отношении питания их азотом. Если азот им давали в виде аммонийных солей сильных кислот, то первой группой являются ростки злаков, содержащие в эндосперме много крахмала. В них азот накопляется в виде аспарагина, аммоний не накопляется.
Второй группой являются ростки бобовых растений, в которых гораздо меньше крахмала (горох, вика). Они, как доказал Дмитрий Николаевич, образуют аопарагин из аммонийных солей только, если прибавить им карбонат кальция, или если они получают, как источник азота, карбонат аммония + СО2.
Третьей группой являются ростки люпина, в которых вообще нет крахмала. В них аспарагин не синтезируется из аммонийных солей в темноте, даже если обеспечить нейтрализацию кислоты путем прибавления карбоната кальция. Аналогичные явления наблюдаются в ростках других растений, если запасы крахмала в них крайне ограничены.
Если аммонийные соли сильных кислот перерабатываются в аспарагин, тогда имеется передвижение кислотно-щелочного равновесия, подобное тому, которое имеет место при образовании мочевины в организме животного. Если животному давать хлорид аммония или сульфат аммония, то получается передвижение этого равновесия в направлении ацидозы; такое же, как при введении свободных сильных кислот. Это применяется и в практической медицина для удаления алкалозы - тетании. В экспериментах акад. Прянишникова это передвижение в опытах с ростками малокрахмальными было компенсировано прибавлением карбоната кальция, или использованием бикарбоната аммония, как источника азота.
Акад. Прянишников смело и логически повел свои эксперименты вперед, и он сумел овладеть дальнейшими факторами так, что ростки ячменя вели себя, как люпин, то есть не образовывали аспарагина, а люпин вел себя, как ячмень, то есть образовал аспарагин из аммонийных солей Каким же образом это получилось?
Если продолжительным этиолированием исчерпать запасы крахмала в ячменных проростках, или если хирургическим способом отрезать эндосперм и этим лишить ростки крахмала, тогда зерновые злаки теряют способность к образованию аспарагина из аммонийных солей, и они становятся чувствительными к их физиологической кислотности.
Если наоборот, давать росткам люпина питательную среду, содержащую глюкозу, или если дать им возможность образования сахара путем освещения и прибавления СО2, то они ведут себя как зерновые злаки, то есть синтезируют аспарагин из аммонийных солей и являются нечувствительными в отношении физиологической кислотности. Экспериментами Дмитрия Николаевича доказано, что разница между указанными типа ми растений — ячменем, горохом, люпином — сводится в действительности к разнице в использовании аммиака в зависимости от снабжения сахаром. Свет действует на ростки люпина как сахар: если освещать в отсутствии СО2, аспарагин не образуется, и аммиак накопляется. Красота и простота этих опытов напоминают некоторые самые красивые эксперименты в физиологии. Напомним известный эксперимент Клод Бернара, которым было доказано, что разница щелочной мочи травоядных и кислой мочи плотоядных сводится только к белковой части их питания. Если он заставлял кролика голодать, то есть жить за счет белков своих тканей, то его метаболизм превратился в метаболизм плотоядных, и кролик выделил мочу кислую, как у собаки.
Трудами Дмитрия Николаевича были точно определены взаимоотношения аммиака, углеводов и аспарагиновой кислоты, и теперь нам придется обсудить сущность механизма этих взаимоотношений. Изучение общего значения, именно дикарбоновых кислот, было дополнено сведениями из биохимии животных того, что было известно из физиологии растений. Напомним открытие, что глутамин имеет функцию детоксикации в организме человека, где фенилуксусная кислота связывается с глугамином так, как другие ароматические кислоты с глицином.
Напомним общие данные о глутамине в тканях животных. Правда, мы не нашли пока аспарагина у животных, но свободная аспарагиновая кислота является у молюска Tritonium nodosum средством химической защиты. Но центральная роль аминодикарбоновых кислот выявилась только в СССР в 1937 г. в работах Браунштейна А. Е. и Крицман М. Г. с открытием переаминирования, то есть непосредственного обмена аминных групп между аминокислотами и альфа-кето-кислотами, в которых одним партнером является обязательно аспарагиновая или глутаминовая кислота, или соответствующая им кетокислота. В самые последние годы было доказано Браунштейн и Азарх, что и в дезаминировании некоторых аминокислот принимают участие промежуточно амитюдикарбоновые кислоты, а М. Г. Крицман и Мелик-Саркисян доказали, что и синтез аланина из пировиноградной кислоты и аммиака, давно осуществленный прямым путем in vitro, физиологическим путем идет все-таки через глутаминовую кислоту, которая образуется из пировиноградной кислоты, путем прибавления СО2 с образованием щавелево-уксусной кислоты и аминированием последней за счет аммиака. Путь от аммиака к аминокислотам идет вообще через аминодикарбоновые кислоты; путь аминогрутапировки от аминокислоты к аминокислоте идет часто таким же путем через аминодикарбоновые кислоты и имеются данные, что физиологический путь от аминокислот к мочевине ведет тоже через аминогруппы глутамина.
В тот же период исследования промежуточного обмена сахара доказали ясно, что кетодикарбоновые кислоты, из которых образуются аминодикарбоновые «ислоты, являются промежуточными продуктами физиологического распада сахаров. Аспарагиновая кислота является побочным продуктом в системе янтарной, фумаровой, яблочной, щавелево-уксусной кислот. Эта система является с сахарном обмене переходным и каталитическим звеном одновременно. Альфа-кето-глутаровая кислота является таким же важным звеном в изолимоннокислом цикле, где она может образоваться из только что названных кислот; из пировиноградной кислоты путем, ведущим через изолимонную и цисаконитовую кислоту в так называемом изолимонном цикле, в котором идет окислительный распад сахаров. Таким образом, два обязательные промежуточные звена связывают этот цикл с азотным циклом Прянишникова.
Второй фундаментальный вопрос, к которому относятся исследования Дмитрия Николаевича, — это вопрос соотношения между ассимиляцией нитратного и аммонийного азота. Предположение акад. Прянишникова, что аммиак является альфой и омегой азотного обмена, не было на первый взгляд в согласии с общепринятым учением о круговороте азота в природе. Как известно, эта теория (одно из величайших достижений биологии и агрохимии XIX века) принимает, что круговорот азота начинается с нитратов почвы, всасываемых корнями растений, которые превращают их в белки. Правда, было известно, что грибы прекрасно ассимилируют аммиак из аммонийных солей. Но в отношении высших растений полагали, (как пишет акад. Прянишников еще в 1945 г., это до сих пор не исчезает со страниц учебников), что предварительное окисление аммиака необходимо для питания растений. Открытое акад. Прянишниковым непосредственное использование азота аммонийных солей молодыми растениями и превращение их в аспарагин противоречило этому положению. Но прав оказался Прянишников.
Агрохимический опыт интегрирует многие факторы, от которых зависит обмен азота в системе растения — почва. Исследования акад. Прянишникова над этой проблемой напоминают нам диалектические основы науки, часто высказываемые крупнейшими исследователями. Дмитрий Николаевич привел в своей последней сводной работе следующий эпиграф: Duclaux «Только потому, что наука никогда ни в чем не уверена, она все время идет вперед». Его работы напоминают и слова Клод Бернара: «Исследователь может делать очень много открытий, если он только дает себе отчет в том, что его эксперимент имеет равные шансы дать результат, соответствующий общепринятому учению, как и совсем противоположное этому учению».
Еще в 1910 г. эксперименты учеников Дмитрия Николаевича доказали, что аспарагин образуется не только в высших растениях, если они питаются аммонийными солями, но также и в нитратной среде; этим была доказана равноценность двух форм азотного питания. Позднее, уже после революции, дальнейшие труды доказали образование аммиака из нитратного иона в ростках, которые не получали или не имели достаточного запаса углеводов. Исследования скорости поглощения аммонийного и нитратного иона из нитрата аммония показали, что обыкновенно аммоний поглощается скорее, и реакция среды передвигается к более кислой. Однако авторы встречали условия, в которых наоборот, содержание аммония в среде даже увеличивалось, и растение выделяло аммиак в среду. Такие эффекты, то есть уменьшение поглощения аммония по сравнению с нитратом, или даже выделение аммония растением наружу, получаются при увеличении возраста ростка и исчерпании им запасов углеводов, а также при увеличении концентрации нитрата аммония и при передвижении рН в кислую сторону (от 7,5 до 4,5). Если люпины питаются нитратом натрия, а реакция остается нейтральной, то можно получить в чистом виде восстановление нитратов и выделение аммония. Акад. Прянишников представил эти соотношения в наглядной схеме.
Экспериментальное искусство Дмитрия Николаевича сделало возможным осуществление подобной серии явлений на ассимилирующих ростках овса.
Запасы углеводов или ассимиляция и концентрация нитратных ионов не являются все-таки единственными факторами, от которых зависит обмен и превращение двух использованных форм азотистого питания. В последние десятилетия школа акад. Прянишникова обращала внимание на влияние других факторов удобрения, а именно ионов кальция и калця: был открыт антагонизм этих ионов в отношении поглощения растениями аммония и нитрата. Например, если концентрация ионов кальция увеличивается, то повышается количество азота, усваиваемого в виде аммонийных ионов.
Труды Дмитрия Николаевича посвящены исключительно глубокому изучению биохимии высших растений и непосредственно не касались биохимии животных. Однако их значение распространяется и на общие основы азотного обмена в организме животных. Теоретические работы Д. Н. Прянишникова являются основой того переворота, который произошел в промышленности искусственных удобрений. Как известно, эта промышленность переходит с выработки нитратов все больше к выработке аммонийных соединений.
Биохимику, который изучает процессы обмена в организмах животных, труды и мысли акад. Прянишникова кажутся очень близкими. Почему? Потому что в этих трудах на каждом этапе выявляются общие черты и общие пути элементарных процессов, которые имеются в растительном и животном обмене. Дмитрий Николаевич на такие общие черты часто обращал наше внимание и то, что мы, более молодые, наблюдаем в первичных реакциях метаболизма, было ему заранее ясно в более сложных балансах физиологических процессов. И это именно в его работах, в которых были открыты «Жизненные явления, общие растениям и животным», представляется величайшим произведением нашего юбиляра, и это ставит его в ряды крупнейших биологов всех времен и всех народов.
